一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法，该方法将一个已知序列样本和一个混合样本的基因组DNA分别进行PCR，并将获得的单链PCR产物按照特定的两核苷酸加入方法进行焦测序，每个样本得到两组两核苷酸合成焦测序信息、并进行校正；将两组校正后的混合样本测序信息和已知序列样本分别进行比较，如果混合样本的测序信息和已知序列样本的测序信息两组信息均无变化，则表明混合样本与已知序列样本测序信息一致，无新突变/SNP位点；如果混合样本的测序信息和已知序列样本的测序信息两组信息中至少存在一组信息不同，则表明混合样本与已知序列样本测序信息不完全一致，表明有新突变/SNP位点存在。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，是一种PCR产物序列分析方法，具体涉及一种通过特定核苷酸加入的实施合成焦测序，从混合样本中发现新突变/SNP位点的方法。
技术介绍
人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。在诸多基因变异中，点突变/SNP是研究基因遗传与变异时一种高效的量化标志。点突变/SNP既与单基因遗传病相关，也可能与多基因遗传病相关。目前已经确定4000多种遗传疾病是由单碱基突变引起的，而一些重大疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病、抑郁症、哮喘等，是受众多基因以及环境因子共同作用，通过对于大量某一特定疾病的基因组样本中突变基因型进行大规模鉴定和检测，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。新突变/SNP的寻找与发现对于研究疾病基因的遗传规律，获得与该疾病相关基因型的信息有着十分重要的意义。如人类基因组单体型图计划(HapMapProject)的实施启动了在整个基因组范围内寻找SNP位点的项目。目前普遍的方法主要通过高通量测序，或者DNA芯片等来实施。这些高通量DNA检测技术可以大规模的并行进行，甚至可以实现整个基因组的全面覆盖。然而，这些优点也伴随着一些劣势，比如相当大的一笔投资、试剂昂贵、周转时间长、数据分析要求高等，同时也伴随着低丰度信息的丢失。这些特点使得高通量DNA测序技术更适用于在基因组范围内目标区域的确定，而对于常规的PCR产物中可能出现的新突变/SNP位点的筛查工作如果采用高通量DNA测序技术进行分析，则成本就会过于巨大。传统的焦磷酸测序技术能够对DNA模板实施定量检测，然而对于PCR产物中含有两个DNA模板的样本而言，焦磷酸测序信息往往随加入核苷酸的顺序不同而不同；同时，包含新突变/SNP位点的DNA模板的丰度一般均比较低，检测信号会被高丰度正常DNA模板掩盖，而不容易被发现。2011年，Lin等人(NucleicAcidsResearch,2011,39(5),e28)利用传统的焦测序技术，提出一种寻找新突变/SNP的方法。然而，这种方式将新突变/SNP的测序信息“没有规律”的分散在高丰度正常DNA模板测序信息中，仍然不容易被发现。根据我们以前提出一种基于两核苷酸实时合成测序的方法(肖鹏峰等，中国专利技术专利：ZL201210128597.6)，它有将增加测序的阅读长度和信号放大提高检测限的特点；此外，它还能够通过不同的两核苷酸组合来实施测序而对同一分析对象得到不同的测序信息，提供更多的测序信息用于序列特征分析。本专利技术依据两核苷酸合成焦测序的特点，将一个已知序列样本和一个混合样本的测序信息进行比较，从而实现对新突变/SNP的寻找。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP的方法，为从混合样本的PCR产物提供一种快速、高效、灵敏的新突变/SNP寻找方法。技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法，该方法包括如下步骤：(1)分别提取标准样本的DNA和混合样本的DNA；(2)分别以标准样本的DNA和混合样本的DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR产物；(3)对步骤(2)得到的PCR产物进行测序，每个样本至少进行两组包含四个核苷酸的两核苷酸合成焦测序，两核苷酸的形式合包括：(dATPαS+dGTP)、(dATPαS+dCTP)、(dATPαS+dTTP)、(dCTP+dGTP)、(dCTP+dTTP)、(dGTP+dTTP)，得到混和样本和标准样本的测序信息；(4)对混和样本和标准样本的测序信息进行校正，再进行关联分析。步骤(3)的具体方法如下：(3-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素修饰的DNA链固定到所述磁珠上，在0.05～0.2MNaOH溶液中变性；将未固定的另一条DNA链清除；得到固定的单链DNA模板；(3-2)测序引物杂交：将测序引物与固定的单链DNA模板在杂交反应体系中，70～80℃下放置5～10min，自然冷却至室温，得到杂交产物；(3-3)测序：配备测序反应体系，与所述步骤(3-2)得到的杂交产物混合，焦测序反应按照两核苷酸顺序加入方式合成进行。步骤(3-2)中，所述测序引物是与固定在磁珠上的单链DNA模板完全互补未标记PCR引物序列中3’末端至少缺失一个碱基的序列，保障混合样本第一个测序信息来自确定碱基。步骤(3)中，两核苷酸参与的每个测序反应获得的测序信息包括两个核苷酸的类型、测序信号强度，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比，即每个测序反应的测序信号强度可以用峰高表示，也可以用通过转化的核苷酸合成的数目表示，可以包括正整数和零，也可以是正非整数。步骤(4)中，对步骤(3)得到标准样本和混合样本的至少两组两核苷酸合成焦测序信息进行校正，所述的校正是次对标准样本和分析样本的焦测序信息进行除法或减法运算；步骤(4)中，所述关联分析为：将两核苷酸加入相同测序条件的标准样本和混合样本的焦测序信息进行比较，得到至少两组标准样本和混合样本的比较数值，所述比较是指依次对标准样本和分析样本的焦测序信息进行除法或减法运算；如果标准样本和分析样本的焦测序信息比较的结果完全一致，即在误差范围内除法运算中相应峰高的比值均为1，或减法运算中相应峰高的值均为0，则表明混合样本与已知序列样本测序信息一致，无新突变/SNP位点；如果标准样本和分析样本的焦测序信息中至少存在一组信息不同，即在误差范围内除法运算中相应峰高的比值至少有一个不等于1，或减法运算中相应峰高的值至少有一个不等于0，则表明有新突变/SNP位点存在，根据两个样本的不同测序信息，推出具体的突变/SNP信息。进一步，所描述的标准样本包括序列已知的DNA单模板样本，或者序列和组成已知的DNA多模板样本。进一步，所描述的两核苷酸合成焦测序信息的校正，通过测序引物合成标准样本和混合样本中共有的已知序列，即与未修饰PCR引物序列中3’末端的一个或者若干个碱基完全互补，而获得至少一个测序信息为基准峰，以之调整因标准样本和混合样本总DNA模板量不一致产生的信号强度不一致。步骤(2)中，所述PCR扩增用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)分别提取标准样本的DNA和混合样本的DNA；(2)分别以标准样本的DNA和混合样本的DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR产物；(3)对步骤(2)得到的PCR产物进行测序，每个样本至少进行两组包含四个核苷酸的两核苷酸合成焦测序，两核苷酸的形式合包括：(dATPαS+dGTP)、(dATPαS+dCTP)、(dATPαS+dTTP)、(dCTP+dGTP)、(dCTP+dTTP)、(dGTP+dTTP)，得到混和样本和标准样本的测序信息；(4)对混和样本和标准样本的测序信息进行校正，再进行关联分析。

【技术特征摘要】
1.一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法，其特征在于，该方
法包括如下步骤：
(1)分别提取标准样本的DNA和混合样本的DNA；
(2)分别以标准样本的DNA和混合样本的DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR
产物；
(3)对步骤(2)得到的PCR产物进行测序，每个样本至少进行两组包含四个核苷酸的
两核苷酸合成焦测序，两核苷酸的形式合包括：(dATPαS+dGTP)、(dATPαS+dCTP)、
(dATPαS+dTTP)、(dCTP+dGTP)、(dCTP+dTTP)、(dGTP+dTTP)，得到混和样本和标准
样本的测序信息；
(4)对混和样本和标准样本的测序信息进行校正，再进行关联分析。
2.根据权利要求1所述的基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法，
其特征在于，步骤(3)的具体方法如下：
(3-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物
素修饰的DNA链固定到所述磁珠上，在0.05～0.2MNaOH溶液中变性；将未固定的另
一条DNA链清除；得到固定的单链DNA模板；
(3-2)测序引物杂交：将测序引物与固定的单链DNA模板在杂交反应体系中，
70～80℃下放置5～10min，自然冷却至室温，得到杂交产物；
(3-3)测序：配备测序反应体系，与所述步骤(3-2)得到的杂交产物混合，焦测序反
应按照两核苷酸顺序加入方式合成进行。
3.根据权利要求1所述的基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP位点的方法，
其特征在于，步骤(3-2)中，所述测序引物是与固定在磁珠上的单链DNA模板完全互补
未标记PCR引物序列中3’末端至少缺失一个碱基的序列，保障混合样本第一个测序信
息来自确定碱基。
4.根据权利要求1所述的一种基于两核苷酸合成焦测序寻找新突变/SNP的方法，
其特征在于，步骤(3)中，两核苷酸参与的每个测序反应获得的测序信息包括两个核苷酸
的类型、测序信号强度，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比，即每个测序反应
的测序信号强度用峰高表示或者用转...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖鹏峰，殷豪景，唐健，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32