用于土霉素检测的电化学适体电极及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于土霉素检测的电化学适体电极，包括玻碳电极，所述玻碳电极外表面从里到外依次附有还原石墨烯-金纳米复合材料层，土霉素抗体层和牛血清白蛋白封闭层。同时提供了其制备方法，本发明专利技术制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中土霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测用传感器
，特别涉及一种用于土霉素检测的电化学适体电极，还涉及所述电化学适体电极的制备方法。
技术介绍
四环素类抗生素是广谱抗生素，已被广泛应用在农业的运作和人类医学中用于治疗传染性疾病。它们在低浓度中操作非常有效,并且仅仅在一个较短的时间后就可以完全从体内代谢出来。然而，过度使用四环素可能导致严重的过敏,在人类安全中的细菌抗性和食品中的安全问题。土霉素（OTC）是四环素中最经常被使用的成员之一。世贸组织（WTO）也对药物和食物中土霉素的最大残留量作了规定。最近报道的检测土霉素（OTC）的方法主要包括高效液相色谱法、荧光法，质谱法和其它方法等。但是这些方法通常比较费时间并且价格相对昂贵。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中针对现有检测方法中检测成本高，仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺点，设计了基于核酸适配子的新型夹心构型的用于土霉素检测的电化学适体电极。本专利技术还提供了所述电化学适体电极的制备方法。本专利技术是通过以下步骤得到的：本专利技术是通过以下步骤得到的：一种用于土霉素检测的电化学适体电极，包括玻碳电极，所述玻碳电极外表面从里到外依次附有还原石墨烯-金纳米复合材料层，土霉素抗体层和牛血清白蛋白封闭层。所述的电化学适体电极，优选还原石墨烯-金纳米复合物的厚度为100±5nm，土霉素抗体的厚度为1μm，BSA的厚度为500±5nm。所述的电化学适体电极的制备方法，优选包括以下步骤：（1）对玻碳电极进行处理洗涤，将氧化石墨烯滴加到电极表面，室温下干燥，用二次水冲洗；（2）浸入氯金酸的硫酸溶液，利用循环伏安一步电还原氧化石墨烯和氯金酸，得到电极表面的还原石墨烯-金纳米复合物，用二次水冲洗，干燥；（3）在表面滴加土霉素抗体的PBS缓冲液，37℃下孵育90min；（4）用0.5%的牛血清白蛋白封闭电极2h，即得。所述的制备方法，优选石墨烯-金纳米复合物是通过以下步骤得到的：（1）石墨粉经过氧化得到氧化石墨烯的制备，（2）氧化石墨烯同氯金酸按照一步电还原制备石墨烯-金纳米复合物。所述的制备方法，优选金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物中，金纳米与核酸适配体以及辣根过氧化物酶的摩尔比为1:2000:50。所述的制备方法，优选步骤（3）中在表面滴加10μL溶解有100μgmL-1土霉素抗体（Ab）的PBS缓冲液，37℃下孵育90min。所述的制备方法，优选还原石墨烯-金纳米纳米复合物是通过以下步骤得到的：玻碳电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用二次水冲洗；20μL1.0mgmL-1氧化石墨烯滴加在已处理好的镜面裸电极上，干燥；之后电极浸入10mL含有2.8mMHAuCl4和0.1M的H2SO4溶液，通过循环伏安一步电化学共还原，得到rGO-Au复合物。其中循环伏安参数：电位设置为0.0到-1.5V，扫描速率0.05V/S。所述的制备方法，金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物是通过以下步骤得到的：（1）金纳米复合物的制备：使用机械搅拌装置，在冷凝回流条件下，还原HAuCl4。具体方案如下：200mL0.01%氯金酸溶液加热至沸，剧烈搅拌的条件下，快速地加入3mL1%的柠檬酸三钠溶液，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢地冷却至室温，置于4℃保存。取60??L金纳米颗粒溶液于微量比色皿，使用紫外可见分光光度计（对其进行光吸收波谱扫描，根据光吸收波长在530nm处的摩尔消光系数3.0×109M-1cm-1，计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nmolL-1。（涉及到的所有玻璃仪器在使用之前，都用王水（V盐酸：V硝酸=3:1）浸泡一夜，超纯水清洗干净。）（2）金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物的制备：同时离心2mL上述制备的金纳米溶液，除上清液，加入300μL二次灭菌水，即浓缩为1nmolL-1。然后一起移到玻璃瓶中，用0.1molL-1NaOH溶液调节pH为8。取出300μL转移到小玻璃瓶中加入磁子，边搅拌边标记：先加入3μL5μmolL-1HRP酶溶液，搅拌10min后，放入4度冰箱，2h后取出，再加入60μL10μmolL-1土霉素的核酸适配体（5′-CGACGCACAGTCGCTGGTGCGTACCTGGTTGCCGTTGTGT-3′），边搅拌边加，搅拌10min后，放入4度冰箱，过夜。过夜后，第二天取出来，边搅拌边加入40.33μL100mmolL-1磷酸缓冲液（PB），10min后，边搅拌边加入13.90μL磷酸盐缓冲液（PBS），加完后继续搅拌30min，放入4度冰箱。过夜，第三天，观察颜色仍为紫红色。平均分成两部分，分别补充灭菌水至1mL，在两个离心管中离心，除去上清液，各补充150μL灭菌水，一起转移到玻璃瓶中。即得300μL1nmolL-1的金标记核酸适配体和辣根过氧化物酶纳米复合物。其中，金纳米与核酸适配体以及辣根过氧化物酶的摩尔比为1:2000:50。（小玻璃瓶和磁子都用王水浸泡，超纯水清洗干净。）本专利技术的工作原理：在玻碳电极上首先修饰增效物质还原石墨烯-金纳米复合物，不但能促进电极表面电子转移，而且增效物质之间的特殊基团的连接能保证它们的层层组装。金纳米粒子与土霉素抗体（Ab）的氨基，通过Au-NH2的作用，把抗体修饰到电极上。然后，抗体（Ab）与土霉素有专一的识别能力，土霉素就能成功修饰到电极上。在土霉素的另一端，依靠金纳米标记有辣根过氧化物酶（HRP）的核酸适体（HRP-Apt）通过核酸适体与目标物的特异性识别能力，也被成功修饰。即，HRP被连接到电极上。在检测过程中，通过电极上的HRP催化检测底液中的对苯二酚（HQ）和双氧水（H2O2）的氧化还原产生电信号，连接电化学工作站，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0.2到0.6V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化，根据电极表面产生的电流的大小起到对目标物检测的作用。本专利技术采用金纳米同时标记核酸适配体和HRP，在金纳米微球的表面能同时固定多个HRP。因此，通过标记，更多的HRP被修饰到电极上。电极上固定的HRP的量与修饰的被检测物土霉素的量有直接关系，被检测物越多，固定的HRP的量也越多，催化产生的电信号也越强。本专利技术采用的石墨烯-金纳米纳米复合物导电性强，成为构建传感器的优良材料；使用辣根过氧化物酶（HRP），通过与H2O2和HQ的反应，放大信号；采用了夹心型的检测模型，分别在检测物OTC的两端引入抗体和适配体，检测更为灵敏；制备的传感器灵敏度高，检测速度快；检测OTC的方法，操作简单、快速、灵敏，便于现场检测。本专利技术的有益效果：1、由于使用玻碳电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用。2、修饰层采用电化学一步还原，反应快速，操作简单。3、反应层是使用表面修饰技术固定在工作电极上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于土霉素检测的电化学适体电极，其特征在于，包括玻碳电极，所述玻碳电极外表面从里到外依次附有还原石墨烯‑金纳米复合材料层，土霉素抗体层和牛血清白蛋白封闭层。

【技术特征摘要】
1.一种用于土霉素检测的电化学适体电极，其特征在于，包括玻碳电极，所述玻碳电极外表面从里到外依次附有还原石墨烯-金纳米复合材料层，土霉素抗体层和牛血清白蛋白封闭层。
2.根据权利要求1所述的电化学适体电极，其特征在于，所述的还原石墨烯-金纳米复合材料层的厚度为100±5nm，土霉素抗体层的厚度为1μm，牛血清白蛋白层的厚度为500±5nm。
3.一种权利要求1或2所述的电化学适体电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对玻碳电极进行处理洗涤，将氧化石墨烯滴加到电极表面，室温下干燥，用二次水冲洗；
（2）浸入氯金酸的硫酸溶液，利用循环伏安一步电还原氧化石墨烯和氯金酸，得到电极表面的还原石墨烯-金纳米复合材料层，用二次水冲洗，干燥；
（3）在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉，徐伟，黄加栋，刘素，王虹智，郭玉娜，许颖，邱婷婷，崔洁，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37