本发明专利技术公开了一种丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）包膜蛋白E2的单克隆抗体（简称单抗）制备及其应用。所述的单抗命名为1C1，由本发明专利技术制备的杂交瘤细胞株1C1（保藏编号：CCTCC NO：C2015199）分泌并筛选得到。该单抗的表位为构象型表位，能够结合来自1a、1b、2a、3、4、5、6型别HCV的包膜蛋白E2。本发明专利技术得到的单抗1C1具有很好中和HCV，降低其感染细胞的能力，可作为丙型肝炎病毒感染后的治疗性抗体，在HCV感染的诊断与预防中具有巨大应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫化学、基因工程和细胞生物学领域。具体而言，本专利技术的目的在于制备一种与丙型肝炎(hepatitisCvirus，HCV)包膜蛋白E2相结合的单克隆抗体的杂交瘤；由该杂交瘤产生的抗HCV包膜蛋白E2单克隆抗体及其相应产品可应用于人感染HCV的诊断试剂或用于治疗或预防HCV感染的药物制备。
技术介绍
HCV感染人体后，约80％HCV感染者常发展成为慢性肝炎，其中约有10％-20％患者发展肝硬化、肝癌(AscioneA,TartaglioneT,DiCostanzoGG.NaturalhistoryofchronichepatitisCvirusinfection.DigLiverDis.2007,39Suppl1:S4-7；JacobsonIM,DavisGL,El-SeragH,NegroF,TrepoC.PrevalenceandchallengesofliverdiseasesinpatientswithchronichepatitisCvirusinfection.ClinGastroenterolHepatol.2010,8:924-933；quize117)，严重影响人类健康，目前尚无有效的疫苗。目前，在HCV的治疗方法上取得了重大的进步，对一些型别的HCV能达到95％以上的治愈率，但仍然有一些抗药性毒株，且HCV具有高度变异性和异质性，在治疗过程中可能很快产生抗性突变毒株(RiceCM,SaeedM.HepatitisC:Treatmenttriumphs.Nature.2014,510:43-44)。因此，从多种途径上研制针对HCV的中和性抗体以及疫苗仍然非常迫切。HCV是有包膜的单股正链RNA病毒，其基因组RNA全长约9.6kb，由5’UTR(～341bp)、3’UTR以及中间的一个长的开放阅读框组成(ChooQL,RichmanKH,HanJH,BergerK,LeeC,DongC,GallegosC,CoitD,Medina-SelbyR,BarrPJ,etal.GeneticorganizationanddiversityofthehepatitisCvirus.ProcNatlAcadSciUSA.1991,88:2451-2455)。HCV感染细胞后，其基因组能编码产生约3000个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白在共转运和翻译后转运过程中，经过病毒和宿主细胞内蛋白酶的剪切，最终形成10种蛋白：3种结构蛋白(核衣壳蛋白Core、包膜蛋白E1和E2)和7种非结构蛋白P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B(GrakouiA,WychowskiC,LinC,FeinstoneSM,RiceCM.ExpressionandidentificationofhepatitisCviruspolyproteincleavageproducts.JVirol.1993,67:1385-1395)。非结构蛋白不会被包装至病毒粒子中。整个病毒粒子是由RNA和core蛋白形成核衣壳，包膜糖蛋白E1和E2组成病毒外壳的主要成分。在病毒感染的早期阶段，由E2与肝细胞表面CD81受体以及清道夫受体BI(SRB1)直接相互作用，介导病毒入侵肝细胞，同时，E2也是中和抗体结合的主要靶点。因而，开发针对E2的中和性抗体将能够在第一步抑制病毒入侵细胞。抗体的产生与抗原表位息息相关。成熟的E2蛋白(翻译后剪切掉N端20个氨基酸信号肽的)大致可分为两个区域：N端的胞外区(aa384-661，对应于HCV多聚蛋白上的位置)以及C端的疏水区(aa661-746)。一般抗原表位被认为存在于胞外亲水区。而E2的胞外结构域含有三个高度变异区：HVR1(384-410aa)、HVR2(474-482aa)、IgVR(431-466aa)(HelleF,DuverlieG,DubuissonJ.ThehepatitisCvirusglycanshieldandevasionofthehumoralimmuneresponse.Viruses.2.11,3:1909-1932；McCaffreyK,BooI,PoumbouriosP,DrummerHE.ExpressionandcharacterizationofaminimalhepatitisCvirusglycoproteinE2coredomainthatretainsCD81binding.JVirol.2007,81:9584-9590)。HCV包膜蛋白的高度变异性使得宿主难以形成有效的保护性免疫，这是HCV逃逸机体免疫清除的机制之一，同时也是HCV疫苗以及中和性抗体开发的主要难题之一。相对于高度变异的基因组以及E2上的高度变异区，E蛋白上的糖基化修饰位点相当保守。在HCV的7个基因型和多个亚型之间，E2上分布的11个糖基化位点中N5和N7(分别为75％和89％)以外的9个都是高度保守的(>％97)(GoffardA,DubuissonJ.GlycosylationofhepatitisCvirusenvelopeproteins.Biochimie.2003,85:295-301；HelleF,GoffardA,MorelV,DuverlieG,McKeatingJ,KeckZY,FoungS,PeninF,DubuissonJ,VoissetC.Theneutralizingactivityofanti-hepatitisCvirusantibodiesismodulatedbyspecificglycansontheE2envelopeprotein.JVirol.2007,81:8101-8111)，这显示了糖苷在HCV生活周期中的重要作用。对这些聚糖的功能分析表明，糖苷的功能是多样的，且不同位置的糖基化修饰功能是不完全相同的：(1)糖基化修饰影响蛋白质折叠，E2N8和E2N10缺失后直接抑制E1E2蛋白的异二聚体的形成，E1N1，E2N3，E2N7，E2N8和E2N10突变导致病毒组装缺陷影响病毒粒子的产量(GoffardA,CallensN,BartoschB,WychowskiC,CossetFL,MontpellierC,DubuissonJ.RoleofN-linkedglycansinthefunctionsofhepatitisCvirusenvelopeglycoproteins.JVirol.2005,79:8400-8409；HelleF,VieyresG,ElkriefL,PopescuCI,Wychowsk本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗丙型肝炎病毒HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1，其特征在于：所述抗体由保藏号为CCTCC NO：C2015199的小鼠杂交瘤细胞株1C1分泌产生，所述抗体的类型为IgG2a型。
【技术特征摘要】
1.一种抗丙型肝炎病毒HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1，其特征在于：所述抗体由保藏号为CCTCCNO：C2015199的小鼠杂交瘤细胞株1C1分泌产生，所述抗体的类型为IgG2a型。
2.根据权利要求1所述的抗丙型肝炎病毒HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1，其特征在于：所述抗体1C1能够结合HCV蛋白的构象型表位。
3.根据权利要求2所述的抗丙型肝炎病毒HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1，其特征在于：所述抗体1C1对HCV有中和作用。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的抗丙型肝炎病毒HCV包膜蛋白E2的单克隆抗体1C1，其特征在于：所述抗体1C1能够结合来自1a、1b、2a、3、4、5、6型HCV的包膜蛋白E2。
5.产生权利要求1所述单克隆抗体1C1的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNO：C2015199。
6.制备权利要求1所述的单克隆抗体1C1的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）构建HCVsE2糖基化突变体的真核表达质粒：将HCV分泌型包膜糖蛋白sE2的融合蛋白克隆入真核表达载体pCDNA3.1，再利用PCR的方法将sE2的第2个糖基化位点的编码氨基酸由天冬酰胺N突变为天冬氨酸D，即sE2N2；具体所述突变是sE2蛋白的sE2-N423RT突变为sE2-D423RT；用糖基化缺失突变体的重组质粒免疫BALB/c小鼠3次，每次间隔3周，末次用原核表达获取的sE2-His蛋白颈背部皮下注射加强免疫一次，一个月后，再次用原核...
【专利技术属性】
技术研发人员：章晓联，闽远琴，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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