用于梨轮纹病菌检测的引物对及检测方法技术

本发明专利技术涉及一项梨轮纹病菌快速检测技术。根据GenBank中登记的轮纹病菌不同种的ITS序列差异，用Primer5软件设计了梨轮纹病菌特异性引物BsF1/BsR2，该引物只能从供试的22个Botryosphaeria berengeriana菌株中特异地扩增出一条332bp的条带，而从其它菌株及空白对照中均未扩增到任何条带。本发明专利技术还提供了所述引物用于梨轮纹病菌的检测方法，可以检测到1ag量的样品DNA，具有特异性好、灵敏度高且耗时短等优点，为病害发生的及时检测和有效控制起到了重要的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及一项用于梨轮纹病菌检测的引物对及检测方法。
技术介绍
梨轮纹病，亦称粗皮病，在我国各梨产区分布广泛，是我国梨树的重要病害之一。该病主要危害梨树枝干、果实和叶片，枝干受害可促使树枝早衰，叶片受害会引起叶片早落，果实受害能造成大量烂果，严重影响产量和品质。我国每年因为梨轮纹病造成梨果减产约25%，严重时烂果率超过80%。梨轮纹病菌(Botryosphaeriaberengeriana)寄主范围广，除梨外，还能危害苹果、桃、李、杏、海棠等多种果树。传统的检测植物病害的方法包括直接观察植物组织的发病症状或者分离得到病原物后再进行形态学鉴定。然而直接观察会遗漏发病初期未表现出症状的情况，且依赖形态学检测方法易受到人为因素和环境条件的干扰，加之传统的分类方法耗时长，程序繁琐，不适合快速检测的要求，很难实现对病害发生的及时监测和有效控制病原菌的传播及病害流行。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供用于梨轮纹病菌检测的引物对和方法。本专利技术根据GenBank中登记的轮纹病菌不同种的ITS序列差异，用Primer5软件设计了梨轮纹病菌特异性引物对BsF1/BsR2，其序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，对供试菌株进行扩增，比较了常规PCR和巢式PCR的检测灵敏度，并对果园采集的感病梨树组织（枝条、叶片和果实）中的梨轮纹病菌进行了快速检测，具有特异性好、灵敏度高且耗时短等优点。所述梨轮纹病菌检测引物对对梨轮纹病菌特异性扩增出一条332bp的条带。本专利技术所述的引物对对梨轮纹病菌的检测方法为：以梨轮纹病菌提取出的的DNA为模版，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，反应结束后取扩增产物于琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统上检测并进行判定。本专利技术提供一种具体的普通PCR检测方法：PCR反应总体积为25μL，包括：模板DNA1μL、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.5μLdNTP、2.5μL10×Buffer、2μLMg2+、0.5μLrTaq酶、17.5μLddH2O；PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。本专利技术提供一种以梨轮纹病菌提取出的的DNA为模版，以真菌通用引物ITS1/ITS4作为第一轮PCR反应引物与特异引物BsF1/BsR2作为第二轮PCR反应引物结合的方式进行巢式PCR检测方法。第一轮PCR反应的混合液总体积为25μL，包括：模板DNA1μL、0.5μL上游引物ITS1、0.5μL下游引物ITS4、0.5μLdNTP、2.5μL10×Buffer、2μLMg2+、0.5μLrTaq酶、17.5μLddH2O；PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸7min。取1μL第一轮PCR反应产物作为模板进行第二轮PCR反应；第二轮PCR反应的混合液总体积为25μL，包括：第一轮PCR反应产物1μL、0.5μL上游引物BsF1、0.5μL下游引物BsR2、0.5μLdNTP、2.5μL10×Buffer、2μLMg2+、0.5μLrTaq酶、17.5μLddH2O；PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸7min。本专利技术所述的引物对检测的靶序列为rDNA-ITS区，其是介于18srDNA、5.8srDNA和28srDNA之间的区域，该区域进化速率较编码区快，在种内不同菌株间高度保守，而在种间存在着丰富的变化，属于理想的靶序列。通过本专利技术所述引物对进行检测，具有特异性好、灵敏度高且耗时短等优点，为病害发生的及时检测和有效控制起到了重要的作用。附图说明图1特异性引物BsF1/BsR2PCR扩增B.berengeriana电泳；图2特异性引物BsF1/BsR2PCR扩增其他菌株产物电泳；图3梨轮纹病菌常规PCR检测；图4巢式PCR检测梨轮纹病菌的灵敏度；图5常规PCR及巢式PCR检测梨树组织的梨轮纹病菌。具体实施方式以下通过具体实施对本专利技术做进一步阐述，但不限制本专利技术。实施例1引物设计根据GenBank中登记的轮纹病菌不同种ITS序列差异，用Primer5软件设计了梨轮纹病菌特异性引物BsF1/BsR2，设计序列为：BsF1：5'-CTTTGTGTACCTACCTCTGTTGCTTTGG-3'；BsR2：5'-GTGCCCAATACCAAGCAGAGCT-3'。实施例2检测方法2.1参试菌株如表1所示表1参试菌株菌株寄主来源菌株数目B.berengerianaPyrussp.江苏9B.berengerianaPyrussp.安徽4B.berengerianaPyrussp.陕西3B.berengerianaPyrussinkiangensisyü新疆2B.berengerianaPyrussp.河南1B.berengerianaPyrussp.山东1B.berengerianaMalussp.山东2B.parvaEucalyptusglobulus中国林业科学院1B.rhodinaEucalyptussp.中国林业科学院1B.eucalyptorumAlbiziafalcalaria中国林业科学院1ColletotrichumgloeosporioidesPyrussp.河南1AlternariaalternataPyrussp.江苏1ValsaambiensPyrussp.南京农业大学1Phomasp.Pyrussp.南京农业大学1MycosphaerellasentinaPyrussp.南京农业大学1VenturianashicolaPyrussp.南京农业大学1ErwiniaamylovoraSolanummuricatum南京农业大学1PantoeastewartiiZeamays南京农业大学1AlternariasolaniLycopersicumesculentum南京农业大学1FusariumgraminearumTriticumaestivum南京农业大学1FusariumsolaniUnknown南京农业大学1PseudomonassyringaeUnknown南京农业大学1RhizoctoniasolaniGlyclnmax南京农业大学1PhomopsisobscuransFragariaananassa南京农业大学1LeqtosphaerialindquistiiHelianthusannuus南京农业大学1MagnaporthegriseaOryzasativa南京农业大学1PhytophthorasojaeGossyphummax南京农业大学1PhytophthoracolocasiaeColocasiuesculenta南京农业大学12.2DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于梨轮纹病菌检测的引物对，其特征在于，其核苷酸序列为：BsF1: 5'‑CTTTGTGTACCTACCTCTGTTGCTTTGG‑3'；BsR2: 5'‑GTGCCCAATACCAAGCAGAGCT‑3'。

【技术特征摘要】
1.用于梨轮纹病菌检测的引物对，其特征在于，其核苷酸序列为：
BsF1:5'-CTTTGTGTACCTACCTCTGTTGCTTTGG-3'；
BsR2:5'-GTGCCCAATACCAAGCAGAGCT-3'。
2.根据权利要求1所述的用于梨轮纹病菌检测的引物对，其特征在于，所述梨轮纹病菌检测引物对对梨轮纹病菌特异性扩增出一条332bp的条带。
3.一种权利要求1或2所述的引物对检测梨轮纹病菌的方法，其特征在于：以梨轮纹病菌提取出的的DNA为模版，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，反应结束后取扩增产物于琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统上检测并进行判定。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于：PCR反应总体积为25μL，包括：模板DNA1μL、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.5μLdNTP、2.5μL10×Buffer、2μLMg2+、0.5μLrTaq酶、17.5μLddH2O；PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
5.一种权利要求1或2所述的引物对检测梨轮纹病菌的方法，其特征在于：以梨轮纹病菌提取出的的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘凤权，赵延存，何锋，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32