本发明专利技术提供通过重组手段生产肽的方法。肽作为包含靶肽和工程改造的内含肽的融合蛋白的一部分表达。本发明专利技术还提供工程改造的内含肽、包含所述内含肽的融合蛋白和编码这些融合蛋白的DNA构建体。在硫醇基诱导切割融合蛋白时，得到靶肽的羧基端α-硫酯。羧基端α-硫酯原则上可与任何亲核体反应，因此该策略允许更大范围的羧基端修饰例如化学连接、生物缀合或酰胺化。本发明专利技术的工程改造的内含肽在大小上被减到最小，并且通过与Mxe GyrA内含肽(SEQ ID NO:1)的3位的比对在相应位置上具有半胱氨酸突变，导致融合蛋白的表达水平提高和分离靶肽的产量较高，因此使本发明专利技术的方法适于生产规模。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生产肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达，其中所述融合蛋白包含靶肽和工程改造的内含肽。专利技术背景肽是一类快速发展的治疗剂，目前市场上有超过50种基于肽的产品，在涵盖诸如免疫学、肿瘤学、神经病学和内分泌学等疾病领域的开发中甚至更多。肽主要通过与特定细胞受体的相互作用调节许多生理机能，籍此它们诱导细胞信号转导事件，例如神经传递和激素的释放。由于其有限的体内稳定性和生物利用度所致，内源性肽作为治疗剂具有挑战。然而，高特异性和低毒性结合选择性修饰和改进肽的治疗性质的改进能力提高肽在药物研发中的关联性。在内分泌学中，疾病常常由肽激素水平失衡引起或与之有关，正如诸如糖尿病和肥胖症等疾病中所见。值得注意的是，内分泌和神经系统中大约一半的肽激素在其C端是α-酰胺化的，而α-酰胺部分对于生物活性和稳定性常常是决定性的。某些治疗性肽，包括涉及肥胖症和糖尿病的肽激素(例如肽YY(PYY)、胰肽(PP)、α-降钙素基因相关肽(α-CGRP)、降钙素(CT)和胰岛淀粉样多肽)，需要在C端中的α-酰胺部分以获得完整的生物活性。用于产生肽治疗剂的最广泛采用的技术是微生物表达系统和化学合成。虽然肽C端酰胺容易通过化学合成获得，但是不容易引入来源于缺乏α-酰胺化酶机制的微生物宿主的重组肽中。因此，α-酰胺必须作为翻译后修饰引入。内含肽是在单细胞生物中表达的在氨基端和羧基端两端具有侧翼蛋白质序列的自身催化性蛋白质结构域。氨基端和羧基端序列被命名为外显肽，这与外显子和内含子的DNA命名法一致。内含肽新兴家族的一个看似典型的成员是蟾分支杆菌(Mycobacteriumxenopi)的GyrA基因产物(MxeGyrA)。其分子量为约22kDa，在氨基端(半胱氨酸)和在羧基端(组氨酸和天冬酰胺)含有多个决定性的氨基酸。另外，羧基端外显肽必须始于半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸。在完成翻译后的某个点上，氨基端外显肽和内含肽间的肽键通过涉及内含肽氨基端半胱氨酸的N至S酰基转移而转化成硫酯键。该键然后在羧基端外显肽的开端与亲核残基(丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸)交换，然后随着天冬酰胺在内含肽C端的参与，内含肽将自身切割出来，同时第二酰基转移在氨基端和羧基端外显肽之间产生天然肽键。这些协同反应的整体作用是两个外显肽无缝连接，且释放出内含肽。设计了突变型内含肽，其中通过突变使自我剪接功能失效，以在氨基端或羧基端剪接点任一个上允许切割。对于MxeGyrA内含肽，通过N198A突变使得氨基端切割成为可能。氨基端外显肽被另一多肽序列即靶肽置换，使得在所得融合蛋白用亲核化学剂(例如2-巯基乙磺酸钠(MESNa))切割后能够制备具有反应性羧基端α-硫酯柄(handle)的靶肽。所述内含肽来源的α-硫酯可与任何亲核体反应，并可用作用于化学连接、生物缀合或酰胺化的化学柄(chemicalhandle)。基于内含肽的方法已被用来重组生产实验室规模的α-酰胺化的肽(WO98/50563A1；WO00/00625A1；CottinghamI.R.等,Nat.Biotechnol.2001,19,974-977)。应用该技术大规模生产C端α-酰胺化肽的主要限制是通常观察到的低产量，这可归因于大的内含肽大小和内含肽融合蛋白水解不稳定性的组合。在MxeGyrA内含肽中引入T3C突变已表明与成熟前裂解降低有关(CuiC.等,ProteinExpr.Purif.2006,50,74-81)。此外，内含肽的大小比肽激素的大小大，且内含肽大小的降低通过更经济地利用宿主蛋白质合成机制，可潜在地改进肽激素的最终产量。专利技术概述本专利技术提供通过重组手段生产肽的方法。肽作为包含靶肽和工程改造的内含肽的融合蛋白的一部分表达，且在硫醇基诱导切割融合蛋白时，获得靶肽的羧基端α-硫酯。羧基端α-硫酯原则上可与任何亲核体反应，因此该策略允许更大范围的羧基端修饰，例如化学连接、生物缀合或酰胺化。基于内含肽的策略的另一个优势是肽α-硫酯通过肽-内含肽融合蛋白的硫解作用产生，潜在地避免了对加工酶的需要。一方面，本专利技术提供用于生产肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤，其中所述融合蛋白包含靶肽和内含肽，其中所述内含肽的大小被减到最小，并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。另一方面，本专利技术提供包含靶肽和内含肽的融合蛋白，其中所述内含肽的大小被减到最小，并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。另一方面，本专利技术提供内含肽，其大小被减到最小，并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。另一方面，本专利技术提供编码包含至少靶肽和内含肽的融合蛋白的DNA构建体，其中所述内含肽的大小被减到最小，并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。由于靶肽的低产量所致，采用基于内含肽的方法的肽α-硫酯的重组生产限于实验室规模，该方法涉及将靶肽作为内含肽的氨基端融合物的表达。本专利技术的工程改造的内含肽在大小上被减到最小，并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上具有半胱氨酸突变，导致融合蛋白的表达水平提高和分离靶肽的产量较高，因此使本专利技术的方法适于生产规模。附图简述图1：编码在含有蛋白酶位点(SEQIDNO:8)的氨基端标签(SEQIDNO:4)和羧基端GyrA内含肽变体(SEQIDNO:17)之间融合的[Gly4]-hPYY4-36(SEQIDNO：10)的质粒1A的代表性pET11a载体图。整个融合蛋白用特征蛋白质1A标记。描绘了NdeI、NheI、NsiI、XhoI和BamHI限制性内切酶位点。载体图中还显示了T7启动子区、氨苄西林抗性基因、lacI阻抑物区和复制起点。图2：制备羧基端修饰的靶肽的基本原理的代表性示意图。使靶肽与可通过亲核切割释放的羧基端内含肽融合，产生作为α-硫酯、α-酰胺或具有合成羧基端片段的靶肽。如本文所示，靶肽进一步与氨基端亲和标签融合，所述标签可以通过通过酶促切割除去。该纯化标签还可置于内含肽的羧基端，避免对加工酶的需要。专利技术描述肽作为治疗剂在包括代谢疾病(例如糖尿病和肥胖症)在内的广泛范围的疾病中越来越有益。包括涉及肥胖症和糖尿病的肽激素(例如PYY、PP、α-CGRP、CT和胰岛淀粉样多肽)的某些治疗性肽在羧基端需要α-酰胺部分以获得完整的生物活性。一个挑战是通过重组手段且特别是呈生产规模地生产所述肽。本专利技术提供工程改造的内含肽，其在大小上被减到最小并在通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应的位置上携带半胱氨酸点突变。内含肽可用于肽的重组生产，其中肽作为包含靶肽和本专利技术的工程改造的内含肽的融合蛋白的一部分表达(参见图2)。通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应的位置上的半胱氨酸突变与内含肽最小化的组合增加本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于生产肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤，其中所述融合蛋白包含靶肽和工程改造的内含肽，其中所述内含肽的大小被减到最小，并且通过与Mxe GyrA内含肽(SEQ ID NO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.05.31 EP 13170009.8;2013.06.10 US 61/8330461.一种用于生产肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤，其中所述融合蛋白包含靶肽和工程改造的内含肽，其中所述内含肽的大小被减到最小，并且通过与MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
2.权利要求1的方法，其中所述内含肽是GyrA内含肽。
3.权利要求2的方法，其中所述内含肽是MxeGyrA内含肽。
4.权利要求3的方法，其中所述内含肽是通过切除相当于MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-164的残基或相当于MxeGyrA内含肽(SEQIDNO:1)的残基107-164的残基的一部分大小被减到最小且其中所切除的残基被包含1-10个氨基酸的接头置换的MxeGyrA内含肽。
5.权利要求4的方法，其中所述接头包含6-10个氨基酸，且其中接头的至少6个氨基酸是甘氨酸和/或丝氨酸。
6.权利要求5的方法，其中所述内含肽的序列是SEQIDNO:20。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：AC肖，JC诺里德，L阿伯特森，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK
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