用于诊断和疗法的外来体中的miRNA生物发生制造技术

本发明专利技术提供通过使用包含miRNA和其前体的外来体来诊断和治疗癌症的方法。例如，在一些方面，癌症可通过确定来自受试者的样品中外来体的miRNA含量或通过检测外来体中的miRNA加工来进行诊断或评估。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/791,301的优先权权益，所述临时申请的完整内容以引用的方式并入本文。本专利技术在政府支持下根据由美国国立卫生研究院授权的授权号EB003472、EB006462、CA135444、CA125550、CA155370、CA151925、DK081576以及DK055001和由美国国家科学基金会授权的授权号EFRI-1240410、CBET-0922876以及CBET-1144025进行。政府对本专利技术享有某些权利。专利技术背景专利
本专利技术大体来说涉及分子生物学、肿瘤学以及医学的领域。更具体说来，其涉及通过癌症的独特的外来体含量来检测癌症的方法和用于基于增强的抑制RNA的疗法的方法。相关技术的描述所有细胞经由多种不同途径与其周围环境通讯，所述途径包括生长因子、细胞因子、激素、趋化因子、膜结合蛋白以及脂质。外来体能够介导所述通讯并且在长距离内实现此举(Mathivanan等人,2010；Kahlert和Kalluri,2013)。经由外来体的通讯可能克服与生长因子/细胞因子/趋化因子/激素的稳定性和扩散有关的限制(Mathivanan等人,2010)。外来体为30-140nm大小的纳米囊泡，其含有由脂质双层保护的蛋白、mRNA以及微RNA(miRNA)(Cocucci等人,2009；Simons和Raposo,2009；Simpson等人,2008；Thery等人,2002)。若干新近研究证明，外来体由多种细胞类型分泌，包括癌细胞、干细胞、免疫细胞以及神经元(Simpson等人,2008；Thery,2001)。应注意，癌细胞比正常细胞分泌更多的外来体(Taylor和Gercel-Taylor,2011)。此外，与正常受试者相比，外来体在癌症患者的循环中增加(Logozzi等人,2009；Taylor和Gercel-Taylor,2008)；然而，功能作用仍然未知。最近有迹象表明，外来体可在癌症进展和转移中发挥重要作用(Luga等人,2012；Peinado等人,2012；Yang等人,2011)。外来体介导细胞之间的RNA和miRNA转移的观点进一步增加了体内细胞-细胞通讯的复杂性。RNAi为活细胞内参与基因表达和活性的控制的天然生物过程。细胞外miRNA最初仅被认为含于外来体内部(Valadi等人,2007)。其后，数项报告确认了凋亡小体(Zernecke等人,2009)、高密度和低密度脂蛋白(Vickers等人,2011)(HDL/LDL)、大的细胞外囊泡(称为微囊泡并且与AGO2有关)(Arroyo等人,2011；Li等人,2012；Turchinovich等人,2011)中miRNA的存在。然而，最近的报告提出在人类血清和唾液中检测到的大多数miRNA主要集中在外来体内部(Gallo等人,2012)。外来体中miRNA的存在提供了在远端位点处调节细胞的基因表达的可能性(Guescini等人,2010；Valadi等人,2007；Mittelbrunn等人,2011；vanBalkom等人,2013)。经由其对mRNA翻译的调节，miRNA协调整个基因集合的表达并且使生物体的转录组成形(Bartel,2009)。miRNA在源于多种不同细胞类型的外来体中富集(Valadi等人,2007)。其为18-24个核苷酸(nt)长的小的非编码RNA，所述RNA控制转录后基因表达。其经由Drosha和Dicer核酸内切酶的顺次作用合成并且装载于所述RISC(RNA诱导的沉默复合物)中以靶向mRNA(Bartel,2009；Maniataki和Mourelatos,2005)。在Dicer基因敲除小鼠中，miRNA生物合成的失败导致归因于缺陷型胚胎干细胞增殖和分化的致死性(Bernstein等人,2003；Fukagawa等人,2004)。微RNA经由miRNA相关RISC(由Dicer、TRBP以及AGO2蛋白构成)与靶标mRNA的序列特异性相互作用和配对操作(Bartel,2009)。这种作用因此抑制翻译和/或引起mRNA去稳定化(Filipowicz,2005)。所述miRNA与其mRNA靶标的互补性程度指示经由mRNA去稳定化/降解或通过抑制翻译所致的mRNA沉默过程(Ambros,2004；Bartel,2009)。如果在所述miRNA与靶标mRNA序列之间遇到完全互补，那么所述RISC复合物用于裂解结合的mRNA以实现降解(Ambros,2004；Bartel,2009)。如果未遇到绝对互补，如在动物细胞中的miRNA的大多数情况下，那么防止翻译以实现基因沉默(Ambros,2004；Bartel,2009)。为了使miRNA具功能性并且实现有效的miRNA介导的基因沉默，其必须与RLC(RISC装载复合物)蛋白Dicer、TRBP以及AGO2复合。在所述RLC内，在Dicer和TRBP经由输出蛋白-5从细胞核显露出来后，需要其加工前体miRNA(pre-miRNA)，以产生miRNA并且与AGO2缔合。结合于成熟miRNA的AGO2构成最小RISC并且可随后从Dicer和TRBP解离(Chendrimada等人,2005；Gregory等人,2005；Haase等人,2005；MacRae等人,2008；Maniataki和Mourelatos,2005；Melo等人,2009)。单链miRNA本身极不良地并入RISC中并且因此无法有效地导向其靶标mRNA用于转录后调节(Tang,2005；Thomson等人,2013)。合成siRNA(双链)通过与其靶标mRNA的完全碱基配对引起mRNA衰变(Ambros,2004；Bartel,2009)。所述siRNA归因于其双链性质直接装载于RISC蛋白Dicer、TRBP以及AGO2中(Tang,2005)。单链miRNA无法并入RISC中并且因此无法导向其靶标mRNA用于翻译抑制或降解(Tang,2005)。一些报告已经提出，含于外来体中的miRNA可影响靶标细胞中的基因表达(Ismail等人,2013；Kogure等人,2011；Kosaka等人,2013；Narayanan等人,2013；Pegtel等人,2010；Valadi等人,2007；Zhang等人,2010)，但问题仍然存在，即如果这些miRNA未作为用于适当mRNA识别和有效翻译本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测受试者中的癌症生物标志物的体外方法，所述方法包括：(a)从所述受试者获得生物样品；(b)测量以下各物的水平：(i)在所述样品的外来体部分中的RISC蛋白；(ii)前体miRNA；(iii)在所述样品的外来体部分中的一种或多种选自表5中所提供的miRNA的miRNA；和/或(iv)在所述样品的外来体部分中的初级miRNA或前体miRNA加工活性；以及(c)基于所述miRNA、前体miRNA、RISC蛋白或miRNA加工活性的所述测量水平来鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.15 US 61/791,3011.一种检测受试者中的癌症生物标志物的体外方法，所述方法
包括：
(a)从所述受试者获得生物样品；
(b)测量以下各物的水平：
(i)在所述样品的外来体部分中的RISC蛋白；
(ii)前体miRNA；
(iii)在所述样品的外来体部分中的一种或多种选自表5中所提
供的miRNA的miRNA；和/或
(iv)在所述样品的外来体部分中的初级miRNA或前体miRNA
加工活性；以及
(c)基于所述miRNA、前体miRNA、RISC蛋白或miRNA加工
活性的所述测量水平来鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志
物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品基本上不含细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品为淋巴、唾液、尿液
或血浆样品。
4.如权利要求1所述的方法，其进一步包括纯化所述样品的外
来体部分或增加所述样品的外来体部分的产量。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症为乳癌、肺癌、头颈
癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺

\t癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述癌症为乳癌。
7.如权利要求1所述的方法，其进一步包括测量所述miRNA中
的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10者的水平。
8.如权利要求1所述的方法，其进一步包括测量DICER、AGO2
或TRBP的水平。
9.如权利要求1所述的方法，其中测量前体miRNA的水平包括
测量表5的所述miRNA中的一者的前体的水平。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者先前已经针对癌
症进行治疗。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述受试者先前具有手术
去除的肿瘤。
12.如权利要求1所述的方法，其中鉴定所述受试者具有或不具
有癌症生物标志物进一步包括使所述测量的miRNA水平、前体
miRNA水平；RISC水平或miRNA加工活性与癌症风险相关联。
13.如权利要求1所述的方法，其中鉴定所述受试者具有或不具
有癌症生物标志物进一步包括使用算法分析所述测量的miRNA水平、
前体miRNA水平；RISC水平或miRNA加工活性。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述分析通过计算机执行。
15.如权利要求1所述的方法，其进一步包括：
b)测量以下各物的水平：
(i)在所述样品和参考样品的外来体部分中的RISC蛋白；
(ii)在所述样品和参考样品的外来体部分中的前体miRNA；
(iii)在所述样品和参考样品的外来体部分中的一种或多种选自
表5中所提供的miRNA的miRNA；和/或
(iv)在所述样品和参考样品的外来体部分中的miRNA加工活性；
以及
(c)通过比较来自所述受试者的所述样品中RISC、前体miRNA、
miRNA或miRNA加工活性的所述水平与所述参考样品中miRNA、
前体miRNA、RISC或miRNA加工活性的所述水平来鉴定所述受试
者具有或不具有癌症生物标志物。
16.如权利要求1所述的方法，其中测量RISC蛋白水平包括执
行蛋白印迹、ELISA或结合于抗体阵列。
17.如权利要求1所述的方法，其中测量miRNA水平包括测量
加工过的miRNA水平。
18.如权利要求1所述的方法，其中测量miRNA水平包括执行
RT-PCR、RNA印迹或阵列杂交。
19.如权利要求1所述的方法，其进一步包括报告所述受试者具
有或不具有癌症生物标志物。
20.如权利要求19所述的方法，其中报告包括制备书面或电子
报告。
21.如权利要求19所述的方法，其进一步包括向所述患者、医
生、医院或保险公司提供所述报告。
22.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
选择根据权利要求1被鉴定为具有癌症生物标志物的受试者；以

\t及
向所述受试者施用抗癌疗法。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗癌疗法为化学疗法、
放射疗法、激素疗法、靶向疗法、免疫疗法或手术疗法。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述抗癌疗法是靶向脑。
25.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
(a)在来自所述受试者的样品的外来体部分中获得以下各物的水
平：(i)一种或多种选自表5中提供的miRNA的miRNA；(ii)前体
miRNA水平；(iii)RISC蛋白；或(iv)miRNA加工活性；
(b)基于所述mRNA、前体miRNA；RISC蛋白或miRNA加工
活性的所述水平来选择具有癌症生物标志物的受试者；以及
(c)用抗癌疗法治疗所述选择的受试者。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述抗癌疗法为化学疗法、
放射疗法、激素疗法、靶向疗法、免疫疗法或手术疗法。
27.一种针对诊断程序选择受试者的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·卡卢利，S·梅洛，
申请(专利权)人：得克萨斯州大学系统董事会，贝斯以色列女执事医疗中心股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US