本发明专利技术涉及一种枸杞番茄红素ε-环化酶基因及包括该基因的重组载体。该基因选自以下核苷酸序列之一：1)具有序列SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)序列SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3'RACE技术克隆了枸杞番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE，得到完整的基因序列为1569。构建了大肠杆菌表达载体pET28a-LmLcyE，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因LmLcyE编码的酶活性进行了鉴定，枸杞番茄红素ε-环化酶基因LmLcyE能够催化番茄红素环化为δ胡萝卜素，使代谢向下游流动，提高α-类胡萝卜素含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种枸杞番茄红素ε -环化酶基因及包括该基因的重组载体，具体为枸紀(Zyci.chinense Miller)中番前红素ε -环化酶基因ZfflLcyE的克隆。
技术介绍
番茄红素的环化反应是是植物体内胡萝卜素生物合成途径重要的分支点。番茄红素ε -环化酶(Lycopene ε -cyclase, LcyE)，能催化番前红素的一端形成δ-环，生成δ -胡萝卜素。类胡萝卜素是C4。的碳氢化合物，广泛存在于植物、一些光合细菌以及藻类中的脂溶性色素，主要包括胡萝卜素(carotenes)和它们的氧化衍生物叶黄素(xanthophylls)两大类。类胡萝卜素在植物光合作用中起着至关重要的作用，它们是光合天线和光反应中心复合体不可缺少的结构成分，还可以保护叶绿素免受强光导致的光氧化破坏。类胡萝卜素是维生素A的前体，具有增强免疫、抗氧化、增进细胞缝间联接交流、预防、延缓及治疗癌症的功能。Aluru等将细菌crtB ipds)和crtl基因串联在一起，在玉米胚乳中特异性表达，胚乳中类胡萝卜素含量提高34倍，并积累了大量的维生素A的前体:β -胡萝卜素。生物系统中一旦形成高度活泼的具有损伤能力的自由基后，就会对细胞遗传物质和细胞膜进行强烈的破坏，导致细胞功能下降，机体衰老以及疾病的发生。类胡萝卜素，尤其是胡萝卜素能抑制、清除体内自由基，可以延缓衰老和预防肿瘤、血栓、动脉粥样硬化等疾病。类胡萝卜素能增加免疫系统中Β细胞的活力、消灭外源入侵的病原菌，能提高淋巴辅助Τ细胞的活力，协助Β细胞产生抗体，并提高其他免疫组分的活性；还能增加自然杀伤细胞的数目，以消除机体内被感染的细胞或癌细胞。据报道，除胡萝卜素外，番茄红素等也有增加免疫力的功能。随着人类对类胡萝卜素药用价值及医疗保健作用的不断发现，对类胡萝卜素的种类和产量的需求也将越来越大，然而，类胡萝卜素很难用化学方法合成。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶的基因被陆续分离鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产类胡萝卜素开辟了道路，特别是通过类胡萝卜素基因工程获得“金色水稻”和“金油菜”，极大地增强了人们开展植物类胡萝卜素基因工程的?目心。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种枸杞番茄红素ε -环化酶基因及包括该基因的重组载体。通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3’ RACE技术克隆了枸杞番茄红素ε-环化酶基因ZMxyE，得到完整的基因序列为1569。构建了大肠杆菌表达载体pET28a_ZMxyE，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞异戊二烯焦磷酸异构酶基因McyE编码的酶活性进行了鉴定，枸杞番茄红素环化酶基因McyE能够催化番茄红素环化为δ胡萝卜素，使代谢向下游流动，提高α-类胡萝卜素含量。本专利技术的第二个目的是提供该枸杞番茄红素ε-环化酶基因编码的蛋白质。本专利技术提供了一种枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE，如序列表SEQ ID N0.1中所示的核苷酸序列。本专利技术提供了一种上述枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZicyE编码的蛋白质，如序列SEQ ID N0.1中所示的氨基酸序列。还包括该所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。本专利技术提供了一种上述枸杞番茄红素ε-环化酶基因ZMxyE重组克隆载体pMD18-T-ZfflLcyE0含有上述的枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE的重组载体，这些重组载体包括质粒。所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-ZfflLcyE。含有上述枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围。所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞。本专利技术提供了一种番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE编码的蛋白在大肠杆菌中的表达应用。本专利技术的克隆方法由下述步骤组成: 从枸杞叶片中提取总RNA，根据转录组Unigene序列中番茄红素ε -环化酶基因核苷酸序列设计上游引物 ZaLcyEF:5’-ATGGAATGTGTTGGAGTTCAAAA TT -3’，然后利用 3’ RACE 方法扩增得到完整的基因序列为1569bp。本专利技术首次从枸杞中分离出编码番茄红素ε -环化酶的完整cDNA。本专利技术构建含番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE的大肠杆菌表达载体pET28a_ZfflLcyE，包括下述步骤: 1)构建含有枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZicyE的中间载体pMD18-T_ZicyE: 设计由序列SEQ ID N0.3所示的上游引物F1，和由序列SEQ ID N0.4所示的下游引物R1，以枸杞番茄红素ε -环化酶基因的cDNA为模板，PCR扩增，将PCR扩增产物连接于PMD18-T载体，获得含有序列SEQ ID N0.1所示的枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZicyE的中间载体 pMD18-T_LfflLcyE。2)构建大肠杆菌表达载体pET28a-Z?LcyE: 设计由序列SEQ ID N0.5所示的上游引物F2，和由序列SEQ ID N0.6所示的下游引物R2 (其中F2 5’端带有Noel酶切位点的碱基，R2 5’端带有ZAol酶切位点的碱基)，以质粒pMD18-T-ZicyE为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经Abel和ZAol酶切后，将大肠杆菌表达载体pET28a经Abel和ZAol酶切，二者进行连接反应，得到大肠杆菌表达载体pET28a-ZfflLcyE0本专利技术提供了一种枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用，首次从枸杞中分离出编码枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE的完整cDNA，连接到大肠杆菌表达载体上，利用外源表达系统验证枸杞ZicyE基因在蛋白水平表达的产物具有酶的活性。本专利技术所述的枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZMxyE可望用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植株。本专利技术通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3’ RACE技术克隆了枸杞番茄红素ε-环化酶基因ZMxyE，得到完整的基因序列为1569bp。构建了大肠杆菌表达载体pET28a_ZicyE，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞番茄红素ε -环化酶基因McyE编码的酶活性进行了鉴定，枸杞番茄红素ε -环化酶基因ZicyE能够催化番茄红素环化，使代谢向下游流动，提高α-类胡萝卜素含量。【附图说明】图1 为 pMD18-T_LfflLcyE 载体示意图。图2为pET28a_ZfflLcyE载体示意图。图3为pET28a_ZfflLcyE酶切验证结果。图4为ZfflLcyE在大肠杆菌中的表达。【具体实施方式】实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1 枸杞番茄红素ε -环化酶基因McyE的克隆: 以 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN，German)试剂盒，从 lOOmg 新鲜枸紀叶片(宁夏枸f己)中提取Total RNA，根据转录组的Unigene序本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个枸杞番茄红素ε‑环化酶基因，其特征在于选自：1) SEQ ID No.1序列所示的核苷酸序列；或2) SEQ ID No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：季静，王罡，吴疆，刁进进，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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