结核感染Treg/Th17细胞的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种细胞的检测方法，具体涉及一种结核感染Treg/Th17细胞的检测方法；Treg/Th17细胞与感染血液结合并且对结核感染Treg/Th17细胞进行检测；采用本方案的结核感染Treg/Th17细胞的检测方法检测准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生命科学领域，具体涉及一种结核感染Treg/Th17细胞的检测方法。
技术介绍
结核病是威胁人类健康的重大传染病之一，据WHO统计，人群中约1/3的人感染了结核杆菌。在抗结核感染过程中，细胞免疫特别是T细胞免疫在抗结核免疫保护中起着重要作用。在结核抗原和共刺激分子共同作用下，初始CD4+T淋巴细胞可分化为辅助型T细胞(Thelpercell，包括Th1、Th2、Th17)和调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)。Th17细胞(CD4+IL-17+)是一类以产生IL-17为主的T细胞亚群，是重要的促炎类辅助T细胞，在抗结核感染及多种炎症反应中发挥重要作用。Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)是一类特异性表达转录因子Foxp3，是重要的具有免疫抑制功能的T细胞，可通过分泌多种细胞因子(如IL-10、TGF-β等)等发挥免疫抑制功能的作用。Th17细胞和Treg细胞在抗结核感染免疫过程中既相互作用又相互拮抗，Th17细胞有助于机体清除体内的病原体，但过度活化可使炎症反应加重从而引起病理损伤；Treg细胞则可抑制过度的炎症反应和病理损伤，但Treg细胞的过度活化也对T细胞的特异性免疫应答反应产生抑制，从而有碍于机体内病原体的清除。因此，对Th17细胞和Treg细胞在抗结核感染过程中的分化、发育、相互作用等的研究将有助于判断疾病严重程度，为结核病的免疫防治提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术意在提供一种结核感染Treg/Th17细胞的检测方法。本方案中的结核感染Treg/Th17细胞的检测方法，包括Treg细胞和Th17细胞的检测，Treg细胞检测包括，取流式细胞检测专用反应管分别加入抗人系列单抗CD45-ECD、CD4-FITC、CD25-PC5和CD127-PE各5ul共计20ul于管底；(2)混匀待测样本后加入50ul样本于管底；(3)室温下避光孵育30分钟→加入溶血剂甲酸625ul，在漩涡混匀器上立即震荡混匀10s钟；(4)再加入265ul溶血终止剂，立即漩涡震荡混匀；(5)室温下1200g离心5分钟；(6)弃上清液，用0.5mlPBS缓冲液重悬细胞；(7)漩涡震荡混匀后上机检测；(8)选择Navios操作菜单中的Treg细胞检测程序；(9)以CD45+CD4+的T淋巴细胞设门；(10)分析Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)的含量；Th17细胞检测包括，(11)取200ul全血标本，用RPMI1640(不含小牛血清-FBS)1:1等体积稀释；(12)加入流式检测专用管中，依次加入：10ul1ug/mlPMA工作液+8ul50ug/mlIonomycin工作液+6.8ul0.1mg/mlMonensin工作液(或8ul0.5mg/mlBFA工作液)，混匀；(13)37℃，5％CO2培养箱培养4-6小时；(14)依次加入CD3-PC5、CD45-ECD、CD4-FITC抗体各5ul,室温避光孵育15分钟；(15)每管中加入100ulFix&Perm中的ReagentA，室温，避光孵育15分钟；(16)每管中加入3mLPBS，1200g离心5分钟，弃除上清；(17)每管中加入100ulFix&Perm中的ReagentB(即破膜和溶血液)，同时各管中加入相应的IL-17-PE；(18)室温下避光孵育15分钟。每管中加入3mLPBS，1200g离心5分钟，弃除上清；(19)0.5mLPBS重悬细胞，上机检测。本次研究共纳入研究对象181例，所有研究对象依据临床表现和预先指定的分组标准进行分组，其中结核感染活动期组66例，包括41例初次确诊感染结核的患者和24例治愈后复发的患者，结核潜伏性感染患者57例，健康对照人群58例。通过分析结核感染不同病程时期患者体内Treg细胞和Th17细胞的表达后发现，活动期组Treg细胞和Th17细胞的比例明显高于在潜伏期组和正常对照组(Treg细胞:9.61±2.26％VS6.31±1.44％和9.61±2.26％VS4.16±1.01％P<0.05；Th17细胞：3.08±0.80％VS1.31±0.50％和3.08±0.80％VS1.15±0.46％P<0.05)，潜伏期组Treg细胞的比例明显高于正常对照组(6.31±1.44％VS4.16±1.01％P<0.05)，但潜伏期组Th17细胞的比例和正常对照组相比无明显差异(1.31±0.50％VS1.15±0.46％P>0.05)。通过研究发现，在结核病潜伏期和活动期患者外周血中，Treg细胞及Th17细胞都表现出明显差异。为进一步研究Treg细胞和Th17细胞在区分结核病活动性感染和潜伏性感染中的临床应用，依据各组中Treg细胞和Th17细胞的表达情况拟合出ROC曲线用以评价各淋巴细胞亚群在区分结核病不同病程中的诊断效益。附图说明图1为Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)流式细胞术分析图；图2为Th17细胞(CD4+IL-17+)流式细胞分析图，其中B2象限为Th17细胞含量；图3(a)为各组间Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)表达差异，*p<0.05；图3(b)为各组间Th17细胞(CD4+IL-17+)表达差异，*p<0.05；图4(a)为Treg细胞用于区分结核感染潜伏期和活动期的ROC曲线，95％CI(0.839—0.938)；图4(b)为Th17细胞用于区分结核感染潜伏期和活动期的ROC曲线，95％CI(0.684—0.756)。具体实施方式本次研究选择2013年12月至2014年7月到本院就诊的结核患者123例，依据临床表现和实验室检查[6-7]将其分为活动期组(66例)和潜伏期组(57例)。活动期组男39例，女26例，年龄16～68岁，平均(36.2±16.8)岁；潜伏期组男28例，女30例，年龄20～65岁，平均(33.2±13.6)岁。活动期组包括初次确诊感染结核的患者和治愈后复发的患者，TSPOT.TB结果和TST结果均为阳性；潜伏期组包括既往感染过结核而目前没有证据表明处于活动期的结核患者，TSPOT.TB结果和/或TST结果为阳性。上述患者诊断均参照中华医学会结核病学分会制定的结核诊断和治疗指南中的标准，并同时排除肝、肾功能严重障碍患者，自身免疫性疾病患者，应用糖皮质激素等免疫抑制剂的患者。选择同期到本院体检的58例健康体检者作为对照组，TSPOT.TB和TST结果均为阴性，其中男27例，女31例，年龄16～76岁，平均(37.7±20.4)岁。依据病史、实验室检查及结核病诊断标准将纳入的研究人员分为三组：活动期组、潜伏期组和健康对照组。活动期组包括肺结核临床诊断病例和其他结核确诊病例。其中临床诊断病例包括连续3次痰涂片检查结果为阴性，而肺部影像学检查结果提示为活动性肺结核相关，且结核菌素试验(TST)、抗结核抗体检查强阳性，经诊断性治疗后有效且伴有咳嗽、咳痰本文档来自技高网...

【技术保护点】
结核感染Treg/Th17细胞的检测方法，其特征在于：用EDTA抗凝管抽取感染静脉血5mL，包括Treg细胞和Th17细胞的检测，Treg细胞检测包括，(1)取流式细胞检测专用反应管分别加入抗人系列单抗CD45‑ECD、CD4‑FITC、CD25‑PC5和CD127‑PE各5ul共计20ul于管底；(2)混匀待测样本后加入50ul样本于管底；(3)室温下避光孵育30分钟，加入溶血剂甲酸625ul，在漩涡混匀器上立即震荡混匀10s钟；(4)再加入265ul溶血终止剂，立即漩涡震荡混匀；(5)室温下1200g离心5分钟；(6)弃上清液，用0.5mlPBS缓冲液重悬细胞；(7)漩涡震荡混匀后上机检测；(8)选择Navios操作菜单中的Treg细胞检测程序；(9)以CD45+CD4+的T淋巴细胞设门；(10)分析Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)的含量；Th17细胞检测包括，(11)取200ul全血标本，用RPMI 1640(不含小牛血清‑FBS)1:1等体积稀释；(12)加入流式检测专用管中，依次加入：10ul 1ug/ml PMA工作液+8ul 50ug/mlIonomycin工作液+6.8ul 0.1mg/ml Monensin工作液(或8ul 0.5mg/ml BFA工作液)，混匀；(13)37℃，5％CO2培养箱培养4‑6小时；(14)依次加入CD3‑PC5、CD45‑ECD、CD4‑FITC抗体各5ul,室温避光孵育15分钟；(15)每管中加入100ul Fix&Perm中的ReagentA，室温，避光孵育15分钟；(16)每管中加入3mL PBS，1200g离心5分钟，弃除上清；(17)每管中加入100ul Fix&Perm中的Reagent B(即破膜和溶血液)，同时各管中加入相应的IL‑17‑PE；(18)室温下避光孵育15分钟。每管中加入3mL PBS，1200g离心5分钟，弃除上清；(19)0.5mL PBS重悬细胞，上机检测。...

【技术特征摘要】
1.结核感染Treg/Th17细胞的检测方法，其特征在于：用EDTA抗凝管抽取感染静脉血
5mL，包括Treg细胞和Th17细胞的检测，Treg细胞检测包括，
(1)取流式细胞检测专用反应管分别加入抗人系列单抗CD45-ECD、CD4-FITC、
CD25-PC5和CD127-PE各5ul共计20ul于管底；
(2)混匀待测样本后加入50ul样本于管底；
(3)室温下避光孵育30分钟，加入溶血剂甲酸625ul，在漩涡混匀器上立即震荡混
匀10s钟；
(4)再加入265ul溶血终止剂，立即漩涡震荡混匀；
(5)室温下1200g离心5分钟；
(6)弃上清液，用0.5mlPBS缓冲液重悬细胞；
(7)漩涡震荡混匀后上机检测；
(8)选择Navios操作菜单中的Treg细胞检测程序；
(9)以CD45+CD4+的T淋巴细胞设门；
(10)分析Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)的含量；
Th17细胞检测包括，
(11)取200ul全血标本，用...

【专利技术属性】
技术研发人员：章明徐，邓少丽，罗杰，张可珺，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;85