新型核酸分子制造技术

在此尤其提供了一种DNA构建体，该构建体包含一个tRNApyl编码序列和一个RNA聚合酶III启动子序列，该构建体能够在真核表达系统中起作用，以表达足以支持无义抑制的功能性tRNApyl。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术尤其涉及新型核酸分子、含有它们的载体、用所述载体转化的真核宿主细胞和宿主细胞系以及它们在蛋白质生产，尤其是含有非天然氨基酸的蛋白质的生产中的用途。引言已观察到，在古细菌的一个亚组(代谢甲基胺的产甲烷古细菌)中天然进化的一个正交RS/tRNA对对于氨基酸吡咯赖氨酸具有特异性。吡咯赖氨酸使用天然进化成正交于所有其他氨基酸和tRNA的第21氨基酰-tRNA合成酶。吡咯赖氨酸是由琥珀密码子可靠地指定的唯一一种天然氨基酸。布莱特(Blight)等人，2004表明PylRS和tRNApyl在大肠杆菌(E.coli)中可在琥珀密码子处掺入吡咯赖氨酸。他们还表明wtPyLRS是天然混杂的并且可掺入赖氨酸的类似物。横山(Yokoyama)等人(EP1911840)展示，PylRS/tRNA系统在真核细胞中是正交的，并且显示出在细菌细胞中将若干nnAA掺入到由琥珀密码子编码的靶蛋白中。这些作者还鉴定了pylRS中形成氨基酸结合口袋且起到相对于其他典型氨基酸选择吡咯赖氨酸的作用的关键氨基酸残基。此位点处的突变产生能够识别tRNApyl并且用AzZ-lys将tRNApyl氨基酰化的突变体(柳泽(Yanagisawa)2008)。这种正交性延伸至细菌和真核细胞。PylRS是天然混杂的合成酶，其天然进化成不包括赖氨酸，但是将在不突变的情况下掺入赖氨酸类似物，包括叠氮化物、炔烃和烯烃(柳泽等人，2008；诺伊曼(Neumann)等人，2008；向井(Mukai)等人，2008；阮(Nguyen)等人，2009)。这种特异性的基础取决于在pylRS结合口袋的氨基酸残基与吡咯赖氨酸的吡咯环之间的疏水性相互作用，其使该氨基酸稳定并且将该氨基酸正确地定位在该合成酶的活性位点中(卡佛兰(Kavran)等人，2007)。此RS/tRNA对已通过瞬时转染引入到细菌、酵母和哺乳动物细胞中并且已显示出对于将多个非天然氨基酸掺入靶蛋白中是有效的。例如，EP1911840展示了在大肠杆菌细胞中将N-ε-boc-赖氨酸掺入靶蛋白中。tRNA在真核细胞中的表达通过RNA聚合酶III(“PolIII”)来进行，需要2型基因内启动子，该2型基因内启动子含有二分结构，在该结构中，通过一个可变序列将已知为A-盒和B-盒的两个短的保守序列元件分开。与哺乳动物tRNA基因相反，原核tRNA基因由基因外启动子元件调控。因此，许多原核tRNA不含在哺乳动物细胞中充当启动子的A-盒和B-盒元件。对于甲烷八叠球菌(Methanosarcina)来源的tRNApyl来说即是如此。将tRNApyl编码序列连同PylRS一起引入哺乳动物细胞中不导致报告基因构建体的琥珀型抑制，推测是由于保守性A-盒和B-盒元件的缺乏(向井等人，2008)。汉考克(Hancock)等人(汉考克等人，2010，美国化学学会期刊(JACS))尝试在来自巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)的tRNApyl基因内重新构建功能性A-盒和B-盒，并且未能证实突变型tRNA基因在酵母中的功能性琥珀型抑制，表明将A-盒和B-盒元件引入tRNA序列中的任何修饰改变了tRNA架构，从而阻碍其总体功能。MmtRNApyl的序列分析显示B-盒与共有B-盒具有显著的同源性，但是A-盒显示出显著的多样性。寻找在哺乳动物细胞中表达抑制型tRNA的最优条件的尝试追溯至1982年(胡德齐亚克(Hudziak)等人，1982，拉斯基(Laski)等人，1982)，在产生用于遗传疾病的基因治疗的无义抑制型tRNA的背景下，其中终止密码子导致关键蛋白质转录的提前终止。引入细胞中的DNA的量、tRNA基因的拷贝数以及驱动其表达的启动子元件已经被鉴定为达到最优tRNA水平，例如，以允许有效活性而不导致对细胞的毒性的关键元件。通过加工双顺反子构建体实现的tRNA的表达已经显示存在于真核细胞中。tRNAarg-tRNAasp的基因组编码基因对(genomicallyencodedgenepair)已在酵母细胞中有所描述(施密特(Schmidt)等人，1980)。此基因表达为单个前体RNA，该单个前体RNA经过转录后修饰，以在体内和在卵母细胞提取物中产生两个成熟tRNA(施密特等人，1980)。在这种情况下，tRNA基因通过由CTTTGTTTCT(SEQIDNo.68)组成的短间隔区分开。这种基因排列还已经用于表达在酵母中正常不表达的tRNA(弗朗西斯(Francis)等人，1990)。此处，含有共有A-盒和B-盒元件，但是在酵母中不转录的人tRNAmet基因当置于tRNAarg元件下游时在酵母细胞中成功表达。诸位作者表明，两个RNA基因的距离影响转录效率。当两个tRNA通过在酵母Arg-AsptRNA对之间存在的短的10bp富含胸腺嘧啶核苷的间隔子分开时，实现了外源tRNA的表达。当居间序列的这种间隔子长度增加(最多至92bp)时，也观察到tRNAmet基因的表达，但是效率较低(弗朗西斯等人，1990)。在另一个例子中，斯特罗比(Straby)(1988)利用双顺反子酵母Arg-AsptRNA基因对来表达正常地转录沉默抑制型tRNAsup(tyr)。在一个构建体中，tRNAsup替代tRNAasp基因并且保留存在于酵母Arg-AsptRNA对之间的短的10bp的富含胸腺嘧啶核苷的间隔子并且显示出有效的tRNAsup表达。tRNA还已经在外部启动子如U6启动子(库昆特拉(Koukuntla)等人，2013；向井等人，2008)、T7RNA聚合酶启动子(向井等人，2008)、SNR52(王(Wang)和王，2012)下表达，并且表达为由上游tRNA基因调控的双顺反子构建体的组分(汉考克等人，2010；弗朗西斯等人，1990；斯特罗比，1988；施密特等人，1980；向井等人，2008)；表达为多聚体如tRNAser(布沃里等人，2000)。向井等人(也参见US8,168,407)以及汉考克等人针对tRNApyl的表达对多种基因外启动子进行了检验。这些包括作为双顺反子构建体的人tRNA，例如tRNAval或tRNAarg。虽然双顺反子系统在酵母细胞中是有功能的(参见汉考克等人)，但是向井等人(2008)报道，在真核细胞中，将tRNApyl基因置于真核tRNA(tRNAval)基因下游导致tRNApyl的次优表达，这并不理想，因为表达水平过低而本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA构建体，该DNA构建体包含一个tRNApyl编码序列和一个RNA聚合酶III启动子序列，该DNA构建体能够在真核表达系统中起作用以表达足以支持无义抑制的功能性tRNApyl。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.15 US 61/801,029;2013.07.09 US 61/843,9591.一种DNA构建体，该DNA构建体包含一个tRNApyl编码序列和一个
RNA聚合酶III启动子序列，该DNA构建体能够在真核表达系统中起作用以
表达足以支持无义抑制的功能性tRNApyl。
2.根据权利要求1所述的DNA构建体，其中该无义抑制是琥珀型抑制。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的DNA构建体，该构建体包含在该
tRNApyl编码序列下游的终止子序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的DNA构建体，其中该构建体包含
tRNApyl基因，该基因包含该tRNApyl编码序列，以及功能性基因内RNA聚
合酶III启动子。
5.根据权利要求4所述的DNA构建体，其中该tRNApyl基因含有在该基
因内RNA聚合酶III启动子的推测性A盒和/或推测性B盒中的1或2个核苷
酸位置上的突变。
6.根据权利要求5所述的DNA构建体，其中该tRNApyl基因含有在该推
测性B盒中的1或2个核苷酸位置(例如1个位置)上的突变。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的DNA构建体，其中该tRNApyl基因
具有或包含来源于马氏甲烷八叠球菌的SEQIDNo7、8、9、10、或11的序
列或具有或包含来源于另一个细菌物种的类似tRNApyl基因的序列，其中在
SEQIDNo7、8、9、10、或11中通过粗体指示的突变发生在等效位置。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的DNA构建体，其中该tRNApyl编码
序列可操作地连接至RNA聚合酶III启动子，其中所述启动子置于该tRNApyl
编码序列的5’。
9.根据权利要求7所述的DNA构建体，其中该5’启动子和该tRNApyl编码
序列通过含有转录起始位点的间隔子序列分开。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的DNA构建体，该构建体包含基因内
启动子元件和5’启动子元件，该5’启动子元件为置于该tRNApyl编码序列5’
的RNA聚合酶III启动子元件，这样使得所述基因内启动子元件和所述5’启
动子元件的组合构成杂合启动子。
11.根据权利要求10所述的DNA构建体，其中所述5'启动子元件为4型
RNA聚合酶III启动子的5'元件。
12.根据权利要求11所述的DNA构建体，其中4型RNA聚合酶III启动子
的该5’启动子元件选自EBERRNA基因启动子、7SLRNA基因启动子以及穹
窿体RNA基因启动子的5’启动子元件。
13.根据权利要求11所述的DNA构建体，其中该5’启动子元件选自SEQID
No12、20、26、57、58、59、60、61、62、63、64以及65。
14.根据权利要求11所述的DNA构建体，其中4型RNA聚合酶III启动子
的该5’启动子元件是7SLRNA基因启动子。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的DNA构建体，其中该5’启动子元
件和该tRNApyl编码序列通过含有转录起始位点的间隔子序列分开。
16.根据权利要求14所述的DNA构建体，其中该间隔子序列选自SEQID
NO13、21以及27。
17.一种多聚体DNA构建体，该构建体包含多个拷贝(例如2至60个拷
贝)的根据权利要求1至...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·迪西，M·马瑞利，K·H·格拉布斯坦，
申请(专利权)人：米迪缪尼有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB