本发明专利技术公开了一株生产L-羟脯氨酸的细菌及其应用。本发明专利技术提供了大肠杆菌HYP035(Escherichia coli.HYP035)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2015401。实验证明，利用本发明专利技术提供的大肠杆菌HYP035(Escherichia coli.HYP035)可以生产L-羟脯氨酸，其发酵液中L-羟脯氨酸产量为45g/L，脯氨酸的转化率达到85％，发酵周期为40h，具有生产价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物领域，具体涉及一株生产L-羟脯氨酸的细菌及其应用。
技术介绍
L-羟脯氨酸为亚氨基酸，不属于20种常见氨基酸，它是脯氨酸羟基化后的产物， 胶原蛋白的主要组成成分，主要应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。近年来 对L-羟脯氨酸的研究和开发已经引起广泛关注：L_羟脯氨酸具有抗氧化、抗辐射的作用， 在美容业方面可作为化妆品添加剂；L-羟脯氨酸具有减肥作用，未来可成为比较理想的减 肥药物；L-羟脯氨酸具有多种生理功能与独特的生物活性，既可作为各种软组织疾病的药 物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，以及治疗各种皮肤疾病；L-羟 脯氨酸作为氨基酸注射液的重要组分，对急慢性肝病所导致的低蛋白血症有一定的疗效； L-羟脯氨酸参与脂肪的乳化及红细胞血红素和球蛋白的形成，具有调节脂肪乳化等作用； L-羟脯氨酸是多种药物，如第三代抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等的合成原料。目 前L-羟脯氨酸世界用量为500吨/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趋势。目前，合成L-羟脯氨酸的方法有化学合成法、生物提取法以及微生物酶法。我国 L-羟脯氨酸的生产主要采用化学水解提取工艺，以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚 硝酸氧化和离子交换等过程制备，"三废"排放量大、污染严重，能耗高、纯度低及生产成本 高，很容易被市场淘汰。而且化学合成方法合成步骤较多，原料来源受限制、成本高、污染环 境，难以实现工业生产。2011年，德国科学家ChristianKlein对含有伴因子的大肠杆菌工 程菌发酵转化生产L-羟脯氨酸的条件进行了优化，测得脯氨酸转化为L-羟脯氨酸的转化 率为61 %，其发酵周期长、底物投入量和转化效率都较低，不适合工业化生产L-羟脯氨酸， 而且对于大肠杆菌工程菌的酶表达，多采用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)做诱导剂，其诱导 效果虽好，但价格昂贵，不适合工业化生产。同时，在以L-脯氨酸为底物直接发酵生产L-羟 脯氨酸过程中，由于宿主菌本身会消耗底物L-脯氨酸，造成L-脯氨酸利用率变低。可见， 开发更为节能、污染少、转化率高的发酵转化法生产L-羟脯氨酸势在必行。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何生产L-羟脯氨酸。 为解决上述技术问题，本专利技术提供了一株可以生产L-羟脯氨酸的细菌。本专利技术所提供的细菌是大肠杆菌HYP035(Escherichiacoli.HYP035)CCTCCNO:M 2015401。该菌株已于2015年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地 址为：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCCNO:M2015401。所述大肠杆菌HYP035 (Escherichia coli.HYP035) CCTCC NO :M 2015401在生产 L_羟脯氨酸中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述应用中，用所述大肠杆菌HYP035 (Escherichia coli. HYP035) CCTCC N0 : Μ2015401生产L-羟脯氨酸的方法可包括发酵培养所述大肠杆菌HYP035 (Escherichia coli.HYP035)CCTCCNO:M2015401，得到L-羟脯氨酸的步骤。 上述方法中，所述发酵培养使用的发酵培养基的溶质及其浓度可为：葡萄 糖 3g/100mL、甘油 0. 5g/100mL、蛋白胨 0. 8g/100mL、硫酸铵 0. 5g/100mL、磷酸氢二钾 0.lg/100mL、氯化钠 0. 2g/100mL、硫酸镁 0. 02g/100mL、硫酸亚铁 0.lg/100mL、氯化钙 0· 0015g/100mL、碳酸钙 1. 5g/100mL、脯氨酸 4. 3g/100mL;溶质可为水；ρΗ7· 0-7. 2。 上述方法中，所述发酵培养的接种量可为10% ±3% (体积百分比）。 上述方法中，所述发酵培养的培养条件可为36°C±2°C培养45±5h，溶氧浓度可 为 40% -50%。 上述方法中，所述发酵培养还可包括制备一级种子液和/或二级种子液。 所述制备一级种子液的步骤如下：（1)将大肠杆菌（Escherichiacoli. )HYP035 单克隆接种于LB斜面培养基，36. 5°C(实际应用中36°C±2°C均可）培养12h(实际应用中 12h±2h均可）；（2)将步骤⑴制备的大肠杆菌HYP035斜面，用5mL无菌水重悬，然后以 2% (体积百分比）（实际应用中2% ±1%均可）的接种量接种到装有一级种子摇瓶培养 基的种子摇瓶（150mL种子摇瓶装液量为30mL)中，36.5°C(实际应用中36°C±2°C均可） 培养12h(实际应用中12h±2h均可），得到一级种子液。 所述一级种子摇瓶培养基溶质及其浓度可为：胰蛋白胨lg/100mL、酵母抽提 物0. 5g/100mL、氯化钠lg/100mL;溶质可为水；pH7. 0-7. 2,121°C高压灭菌15min冷却至 60°C，加入氨苄青霉素，使氨苄青霉素在体系中的浓度为100μg/mL。 所述制备二级种子液的步骤如下：（1)将上述方法制备的一级种子液60mL以 〇. 5% (体积百分比）（实际应用中0. 5% ±0. 2%均可）的移种量接入装有二级种子培养基 的发酵罐（30L发酵罐装液量为12L)中，36°C(实际应用中36°C±2°C均可）培养8h(实 际应用中811±211均可），溶氧浓度可为50%(实际应用中50%-70%均可），得到00 61。约 为25 (实际应用中25±2均可）的二级种子液。 所述二级种子培养基溶质及其浓度可为：蛋白胨1.5g/100mL、酵母抽提物 2. 5g/100mL、磷酸二氢钾 0· 24g/100mL、磷酸氢二钾 1. 6g/100mL、甘油 0· 5g/100mL;溶质可 为水；ρΗ7· 0-7. 2,121°C高压灭菌 15min。 结果表明，利用本专利技术提供的大肠杆菌（Escherichiacoli. )HYP035可以生产 L_羟脯氨酸，其发酵液中L-羟脯氨酸产量为45g/L，脯氨酸的转化率达到85%，具有较高的 生产价值。 与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：以强启动子tac为脯氨酸羟化酶基因的 启动子，相比其他启动子基因可明显提高脯氨酸羟化酶基因的表达量，tac为组成型启动 子，在发酵生产L-羟脯氨酸的过程中不需进行诱导表达，降低诱导剂的使用，减少环境污 染；通过引入proC基因提尚宿主菌合成腫氣酸代谢途径关键酶基因的表达量，提尚菌体在 代谢过程中合成脯氨酸的量，可减少底物脯氨酸的投放量；putA基因的敲除也能有效地降 低菌体本身代谢对L-脯氨酸的消耗，提高L-羟脯氨酸的转化率，降低生产成本，提高产品 收率和质量，并且降低成本，是适合工业化发酵转化生产L-羟脯氨酸的方法。 保藏说明 菌种名称：大肠杆菌拉丁名：（Escherichiacoli.) 菌株编号：HYP035 保藏机构：中国典型培养物保藏中心 保藏机构简称：CCTCC 地址：中国武汉武汉大学 保藏日期：2015年6月25日 保藏中心登记入册编号：CCTCCNO:M2015401【附图说明】 图1为出发载体PBR322的结构示意图。 图2为重组质本文档来自技高网...
【技术保护点】
大肠杆菌HYP035(Escherichia coli.HYP035)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2015401。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄建忠，吴伟斌，郭小雷，黄平，吴松刚，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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