本发明专利技术公开了一种检测A型猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒及其用途。所述试剂盒主要由四条LAMP引物、LAMP反应液和阳性模板组成。实验证明，本发明专利技术试剂盒具有良好的特异性、灵敏度，扩增快速、高效，且结果判定简便。本发明专利技术的检测体系在63℃等温条件下，能快速、特异、高灵敏度地检测到H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒，不需要复杂仪器，操作简单，能较好满足对猪流感病毒的现场检测，为动物流感病毒检测提供了新的技术平台，能较好的满足目前对养殖场、兽医诊断服务机构、出入境检疫等部门现场检测的迫切需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测猪流感病毒的引物以及试剂盒，尤其涉及用于检测A型猪流 感病毒的通用型RT-LAMP引物组、以及检测A型猪流感病毒的通用型RT-LAMP试剂盒。本 专利技术属于生物检测
技术介绍
流感病毒（Influenzavirus)属于正粘病毒科流感病毒属。流感病毒基因组是由 8条负链RNA节段组成，编码11或12个蛋白。猪流行性感冒（Swineinfluenza，SI)是由 猪流感病毒（Swineinfluenzavirus，SIV)引起的猪的一种急性、传染性呼吸器官疾病。 其特征为突发，咳嗽，呼吸困难，发热及迅速转归。该病流行传播迅速，导致猪群生产性能严 重下降并伴随死亡。目前，SI在世界范围内广泛存在，主要流行亚型为H1NUH1N2和H3N2。 猪流感的另一危害是其与人流感密切相关。2009年4月引起全球范围爆发的甲型H1N1流 感（PandemicH1N1/2009,ρΗΙΝΙ/2009)，对人类的生命和财产安全都造成了巨大的损失。研 究表明该病毒8个基因片段均来自于SIV，又一次地突出了猪作为中间宿主及其在流感病 毒跨种间传播中的重要作用。 2009年以前，我国猪群中主要流行经典型（Classical，CS)HlNl、（Eurasian avian-like,EA)H1N1 和北美三重组（Triplereassortant，TR)HlN2,很少发生基因重组。 2009年甲型H1N1流感大流行毒株的在短时间内造成全球人的感染，继而又从人传播到包 括猪在内的其他哺乳动物，该病毒目前已经在北美、欧洲及亚洲等多个国家的猪群中分离 至丨J，并且在一些国家已经分离到2009甲型H1N1流感病毒与传统猪流感病毒的基因重组病 毒。我国于2009年11月份从猪群中监测到该新型病毒的存在，监测结果显示ρΗΙΝΙ/2009 流感病毒在猪群中持续存在，和EA-H1N1以及TR-H1N2以及人源H3N2共同流行于我国猪 群当中，产生了多基因型的重组病毒，并且该类病毒对猪表现出不同程度致病性，可导致猪 的生产性能下降。猪在流感病毒变异与种间传播过程中具有重要的公共卫生意义，禽流感 病毒和人流感病毒均可感染猪，多种来源的流感病毒在猪体内可发生基因片段交换，产生 新的病毒可能跨越种间屏障传播到人群当中。在北美、欧洲和亚洲等地区，近年来SIV感 染人的事件多有发生，对人类健康和生命造成巨大的威胁。ρΗΙΝΙ/2009类病毒对猪群的感 染改变了我国猪流感流行病学状况，产生了多基因型的SIV，形成多基因型SIV共流行的 态势。从这一角度讲，一个有效的诊断方法必须能对当前所有流行的SIV(包括CS-H1N1、 EA-H1N1、pHlNl/2009、TR-H1N2和H3N2)检出，才能满足准确诊断的需要。 常规的SIV诊断方法有：病毒分离、血凝（HA)及血凝抑制（HI)试验、酶联免疫吸 附试验（ELISA)、免疫组织化学（IHC)等，随着分子诊断技术的发展，RT-PCR以及荧光定量 PCR等方法也应用到SIV的检测工作当中。然而，有些方法存在检测周期长、灵敏度不高、特 异性不强的问题，有些方法需要特殊的仪器设备，不适合养殖场和动物疾病诊断机构临床 样本的检测。如今，随着对动物疾病快速诊断的需要的增加，迫切需要适合养殖场、动物疾 病诊断机构和边境口岸的简便、快速检测方法及试剂。 反转录-环介导等温扩增（Reversetranscriptionloop-mediatedisothermal amplification,RT-LAMP)技术是一种等温核酸扩增技术，其特点是针对祀基因的6~8个 区域设计4~6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（60-65Γ)保温30~ 60分钟，即可完成核酸扩增反应。产物检测便捷，LAMP在合成DNA的同时产生大量的焦磷 酸根离子，它们能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据反应体系中是否形成白 色沉淀来定性判断LAMP反应结果。与其他的检测技术相比，具有方便快捷、特异敏感、稳定 性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观的特点。与常规RT-PCR相比，该方法不需要模 板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，反应速度更快。该技术在灵敏度、特异性和 检测时间等指标上能媲美甚至优于RT-PCR技术；由于不依赖任何专门的仪器设备可实现 现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量RT-PCR，目前这一技术已经被用于多种病 原微生物的检测。 流感病毒第7基因节段编码包膜蛋白，包括基质蛋白（Ml)和膜离子通道蛋白 (M2)。相对于其他基因片段，A型流感病毒的Μ基因编码区很少出现变异，非常保守，被认 为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白，所以通常作为流感通用型疫苗研制以及诊断方法的 建立的目标基因。 自 2009 年以来，CS-H1N1、ΕΑ-Η1Ν1、pHlNl/2009、TR-H1N2 和Η3Ν2 亚型SIV共 流行于我国猪群当中，目前未见有能根据当前流行病学情况研制的检测SIV的LAMP诊断 试剂盒，因此迫切需要根据我国猪流感分子流行病学发展状况，建立快速、敏感和特异的 RT-LAMP诊断方法并组成试剂盒，以满足各级动物疾病诊断实验室和相关机构快速检测 SIV病原的需要。 本专利技术以我国猪流感分子流行病学研究为基础，以Μ基因为目标基因，设计 RT-LAMP引物组，以此为技术核心，提供一种可检测包括CS-H1N1、ΕΑ-Η1Ν1、ρΗΙΝΙ/2009、 TR-H1N2 和H3N2 亚型SIV的RT-LAMP试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单、特异性强、敏感性高、结果判定直观的检测A 型猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒及其用途。 为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段： ⑴从GenBank检索获得自2004年1月1日至2014年6月30日所有公开发布的 我国A型猪流感病毒的Μ基因序列，通过DNAstar基因序列分析软件进行同源性分析。获 得A型猪流感病毒Μ基因的特异性的保守靶序列； (2)根据步骤⑴所得的保守靶DNA序列，设计得到SEQIDΝ0 :1~4所示的 RT-LAMP引物； 本专利技术设计得到的用于检测A型猪流感病毒的RT-LAMP引物组由一对外引物和一 对内引物组成，其中，所述外引物的序列分别为SEQIDN0:1和SEQIDN0:2所示，所述内 引物的序列分别为SEQIDN0 :3和SEQIDN0 :4所示。 (3)根据所得的RT-LAMP引物配制LAMP反应液，构成检测体系，进而组装成一种用 于检测A型猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒。 本专利技术的一种用于检测A型猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒，其包含以下组分： (1)LAMP反应液：由以下成分组成：10 X ThermoPol缓冲液2· 5μL;25mM MgS046μL;5M甜菜碱 5μL;10π?Μ(1Ν?'Ρ2·5μL;5μΜ3|?|^Ρ31μL;5μΜ3|@Β31μL;40μΜ3|@ΡΙΡ1μL; 40μM引物BIP 1μL;8U/μLBst酶1μL;5U/μLAMV逆转录酶1μL以及灭菌ddH20 1μL； 其中，引物F3和Β3为外引物，其序列分别为SEQIDNO:1和SE本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测A型猪流感病毒的RT‑LAMP引物组，其特征在于所述RT‑LAMP引物组由一对外引物和一对内引物组成，其中，所述外引物的序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述内引物的序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨焕良，陈化兰，陈艳，乔传玲，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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