本发明专利技术提供了一种实时监测G‑四联体形成的单颗粒SPR探针的制备和应用。基于贵金属(金、银等)纳米颗粒的良好的生物相容性、大比表面积和SPR高灵敏性，采用可与钾离子特异结合的端粒Aptamer对贵金属纳米颗粒进行表面修饰，简单、方便的构建了可高灵敏检测钾离子并实时监测G‑四联体形成过程的单颗粒生物探针。特异性结合的整个过程可以通过暗场显微镜(DFM)和散射光谱仪联用下的单个贵金属纳米颗粒的SPR光谱峰移动量来表征。此探针具有实时检测的功能，且检测速度快，灵敏度高，检测范围宽等优点。此外，可通过数据拟合分析得到形成G‑四联体的解离常数Kd和吉布斯自由能ΔG，以及在形成过程中的两种结合位点形态。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR探针的制备和应 用 本专利技术具体涉及一种可高灵敏检测钾离子、并实时监测G-四联体形成过程的方 法，属于纳米材料生物应用领域。
技术介绍
贵金属（金和银等）纳米颗粒在入射光照射下，界面的自由电子和光子发生共振 运动形成等离子体共振效应。当金属纳米颗粒直径大于或近似于自由电子的平均自由程 时，颗粒受激后将产生明显的散射现象，由于该现象主要发生在表面，因此被称为表面等离 子共振（surfaceplasmonresonance,SPR)散射。研究发现，其散射光谱主要依赖于纳米 颗粒的形状、大小以及颗粒和其周围环境的介电常数。纳米颗粒的形貌和尺寸的不同，将引 起表面自由电子密度、电子震荡频率的变化，从而造成包括吸收和散射光学性质的变化。基 于的SPR散射本身独特的光学性质，对基于SPR散射的纳米结构体系的研究已成为迅猛发 展的热点研究领域之一，即表面等离子体光子学。表面等离子体光子学包含非常广泛的研 究内容，例如表面电场增强光谱、表面增强拉曼光谱、表面等离子体纳米波导、表面等离子 体光催化、表面增强的能量转移及选择性光吸收等，尤其是表面等离子共振生物传感已经 成为重要的分支之一，该方法是在单颗粒上实现单分子水平检测的有效手段。目前基于纳 米等离子体界面微环境的折射率变化、生物分子分布以及纳米颗粒间或复合物颗粒核-壳 间强烈的耦合作用，并结合暗场显微镜与光谱仪的优势，可以在纳米尺度开发出具有极高 灵敏度的单分子水平的生物探针、新型的生物成像试剂或治疗试剂。 G-四联体是一种特殊的核酸二级结构，广泛存在于人类基因组DNA以及RNA中，如 DNA的端粒序列、基因的启动子序列、RNA的5'端非翻译区（5'UTR)序列等。许多研究发现， G-四联体结构在基因的稳定性、端粒合成过程、基因转录和翻译水平的表达调控、基因重组 等生命过程中起着至关重要的作用。富含鸟苷酸的DNA或者RNA在单价阳离子，如Na+、K+、 NH4+、Rb+等存在的条件下，均能形成稳定的G-四联体二级结构。4个鸟嘌呤碱基通过氢键 的配对方式形成G-4平面，适当的阳离子可以使多个G-4平面堆叠形成G-四联体结构。阳 离子中体积最适合嵌入G-四联体结构的是K+，K+对G-四联体的稳定作用最为显著，而真核 细胞内往往具有相对较高的钾离子浓度，因而提示在细胞内的钾离子作用下，有利于G-四 联体的形成，并发挥生物学效应。 目前，检测钾离子的方法有很多，例如：荧光法、电化学法、比色法等，但是这些检 测方法所依据的探针因为尺寸和灵敏度的问题，在应用中有很大的局限性。
技术实现思路
为了得到高灵敏的小尺寸钾离子探针，本专利技术设计了基于单个贵金属纳米颗粒的 SPR探针，实现了高灵敏检测钾离子并实时监测G-四联体形成过程的功能，此SPR探针的测 定过程的实现了无标记，检测速度快，灵敏度高，检测范围宽等优点。 制备过程如下： 1、一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR探针的制备 首先，用种子生长法合成~50nm的金纳米颗粒，采用如下方法制备： 步骤1.合成颗粒 ⑴种子合成 在反应瓶中加入100mMCTAB(aq)和10mMHAuC14 (aq)，在磁力搅拌器上搅拌使其 混合均匀，将冰水浴过的现配10mM的NaBH4(aq)快速加到CTAB和HAuC14的混合溶液中， 溶液瞬间由黄色变成棕色；将得到的种子溶液在28°C水浴中保温3h。 (2)30nm金球的合成 在反应瓶中加入200mMCTAC(aq)和0· 01M的HAuC14(aq)混合之后用磁力搅拌使 溶液均匀；l〇〇mM新配制的抗坏血酸溶液迅速加进混合溶液，之后黄绿色的溶液瞬间变成 无色透明溶液；搅拌均匀后快速加入步骤1的棕色的金种子溶液，整个溶液慢慢变为亮红 色透明胶体；在36°C水浴中保温lh。 (3)合成AuOAg核壳纳米立方体 在反应瓶中加入3mL的30nm金纳米颗粒的溶液和0. 2MCTAC溶液，混合均匀 后加入抗坏血酸溶液，然后将反应瓶中在60°C恒温水浴中保温，10mM的硝酸银溶液以 0. 5mL/10min速度在加液栗辅助下滴加到恒温60°C反应瓶中，在水浴中恒温静置4h之后离 心处理。 步骤2.制备纳米探针： 将ΙΤ0玻璃浸泡在大小约50nmAu@Ag核壳纳米颗粒溶液中，通过物理吸附作用将 AuOAg核壳纳米立方体固定在ΙΤ0基底上；然后将200yL的Aptamer(5'-TTTTTTTTTTGG GTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTTTTTTTTT-3' -(CH2)6-SH)滴在ΙΤ0 玻璃上，放在 37°C 的摇床中；分别固定不同时间，用超纯水冲洗掉表面多余的Aptamer。如图1所示是InM的 Aptamer修饰Au@Ag纳米颗粒2. 5h的实时SPR光谱峰值移动图。结果得到Aptamer的最佳 修饰浓度0. 5-10nM，最佳修饰时间l_4h。 2、一种实时监测G-四联体形成的单颗粒SPR探针的应用，对钾离子的检测： 1)在制备的探针上分别滴加180μL不同浓度的钾离子溶液，通过采集SPR散射光 谱数据，得到lh时探针在不同浓度的钾离子作用下的SPR光谱的峰值与时间之间的关系曲 线如图2所示，钾离子10 7-10 2M不同浓度的作用下在lh动态平衡时的SPR光谱的峰值，分 别是 15. 3nm，14. 748nm，13. 98nm，10. 747nm，6. 67nm，2. 81nm。以及SPR光谱的峰移动量与 钾离子浓度之间的关系如图3所示。钾离子溶液的浓度为10 9-10 2M是S型曲线；其中在 10 7-10 4M范围内具有良好的线性关系，最低检测限达到InM。 2)数据分析 用公式（1):，拟合该探针在不同浓度的钾离子的影响下的 SPR光谱的峰值与时间之间的关系曲线，得到25°C时G-四联体解离常数Kd;钾离子的浓度 0.1以]?-0.11111，分别对应的11值分别是0.89，1.27，1.37，1.49，1.87,2.01，6-四联体形成 过程中可分为两种结合位点形态；用公式（2)=-RTlnKep，分析SPR光谱的峰移动量与钾离子浓度之间的关系，得到不同浓度的钾离子 与AG的线性关系如图4所示，钾离子浓度与AG具有良好的线性关系。用公式（5)AG= △GH2()-mCK+拟合图4得到在形成稳定G-四联体结构时候的吉布斯自由能△G。 有益效果 本次研究将AuOAg核壳结构纳米颗粒和Aptamer组装成可高灵敏检测钾离子的生 物探针，并实时监测G-四联体形成过程。此探针对钾离子的特异性结合的整个过程可以通 过暗场显微镜（DFM)和散射光谱仪联用下的单个贵金属纳米颗粒的SPR光谱峰移动量来表 征。此探针具有实时检测的功能，且检测速度快，灵敏度高，检测范围宽等优点。此外，可通 过数据拟合分析得到形成G-四联体的解离常数心和吉布斯自由能AG，以及在形成过程中 的两种结合位点形态。【附图说明】 图1是本专利技术中本专利技术中Aptamer修饰AuOAg纳米颗粒的实时SPR光谱峰值移动 图。 图2是本专利技术中不同浓度的钾离子作用下的SPR光谱的峰值与时间之间的关系曲 线图。 图3是本专利技术中SPR光谱的峰移动量与钾离子浓度之间的关系图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种实时监测G‑四联体形成的单颗粒SPR探针的制备,包括合成颗粒(1)种子合成；(2)30nm金球的合成；(3)合成Au@Ag核壳纳米立方体，其特征在于，还包括制备纳米探针，具体为：将ITO玻璃浸泡在大小约50nmAu@Ag核壳纳米颗粒溶液中，通过物理吸附作用将Au@Ag核壳纳米立方体固定在ITO基底上；然后将200μL的Aptamer(5’‑TTT TTT TTT TGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG GTT TTT TTT TT‑3‑(CH2)6–SH)滴在ITO玻璃上，放在37℃的摇床中；分别固定不同时间，用超纯水冲洗掉表面多余的Aptamer；在不同浓度的钾离子溶液中检测探针，测得不同移动量的SPR光谱峰值，结果得到Aptamer的最佳修饰浓度0.5‑10nM，最佳修饰时间1‑4h。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，田媛媛，汪联辉，沈晶晶，范曲立，黄维，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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