人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用，该检测卡包括底板、样品垫、吸水垫、结合垫和检测层；结合垫包被有量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针；检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；检测线包被有鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白多克隆抗体；质控线包被有抗兔IgG；检测层粘贴在底板上；结合垫和吸水垫分别设置在检测层两端部上方且与检测层部分重叠后分别与检测层和底板粘贴；样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴。本发明专利技术具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点。

【技术实现步骤摘要】
人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学检测
，具体为一种人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用。
技术介绍
流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)是感染人类的一种重要的呼吸道病原微生物，该菌由波兰细菌学家费佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中发现的，在随后的时间里被研究者们广泛研究。现仅知人是该病原体的宿主。免疫力较差的老人和儿童为易感人群，特别是5岁以下的婴幼儿。Hi可引发肺炎、结膜炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等，在全球每年至少有300万严重病例发生，可造成患儿致残甚至死亡。Hi分为有荚膜的a、b、c、d、e、f共6个血清型和无荚膜的不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilusinfluenzae，NTHi)，一度以荚膜b型Hi最为流行。目前我国开展的Hi血清学检查大多也只针对侵袭力较强的荚膜b型。而由于该型菌株荚膜多糖疫苗的成功研发与应用，其流行已被有效控制。近来的研究多显示，在感染Hi的患者中最常见的菌株是NTHi，其分离率已达50％以上。临床上由于Hi与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床表现、x-射线检查等得出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。婴幼儿疾病的特点是起病急、转归快，因此敏感、快速、实用的Hi检测对及早进行有效的临床干预具有非常重要的意义。尽管流感嗜血杆菌在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前，Hi感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体直接检测法。检测血清中HiIgG、IgA、IgM抗体常用的方法有：微量免疫荧光抗体检测(MIF)，补体结合试验(CF)，重组酶免疫测定(rEIA)，血清补体结合一酶免疫测定试验(SeroCF—EIA)等。然而Hi抗体的检出只能说明该个体感染过Hi，却不能反映体内是否仍有Hi活菌存在，并且血清学特异性抗体检测常需要根据IgM抗体的动态结果进行判断，需要较长的时间。更重要的是，血清学检测的主要检测对象为抗荚膜抗体，而NTHi由于没有荚膜，则会造成漏检。同时，这些技术均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员操作、重复性差、检测时间长、检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需要。核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)，核酸杂交检测Hi的特异性强，但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测；PCR具有较高的敏感性，但PCR实验对实验室有特殊要求，标本处理、扩增和检测要求严格，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。病原体检测方法主要为病原分离培养法，将标本接种于添加了V和X因子的巧克力血琼脂培养基上，经24小时培养后，挑取可疑菌落经形态学鉴定后，用Hi鉴定卡、Vilek一60细菌自动分析系统鉴定到种，系统自动进行生物分型。但该法存在操作步骤复杂，细胞培养时间长等明显缺陷，并不适合临床应用。更重要的是，其中的荚膜肿胀实验等仅限于对有荚膜的菌株进行鉴定，而无荚膜型(NTHi)则全部漏检。因此，目前建立具高灵敏度、高特异性的人流感嗜血杆菌抗原快速检测法以满足临床的检测需求就显得非常必要了。
技术实现思路
本专利技术针对
技术介绍
中现存的几种人流感嗜血杆菌在检测方式中遇到的技术瓶颈，提出了一种具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点的人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用。本专利技术的目的是通过以下技术手段来实现的：一种人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡，其特征在于：所述人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针；所述检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白多克隆抗体；所述质控线包被有抗兔IgG；所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。作为优选，本专利技术所采用的量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点。作为优选，本专利技术所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。作为优选，本专利技术所采用的检测层长2cm，所述检测层粘贴在长度是6.6-7.7cm的底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm；所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2—0.4cm；所述检测线与质控线的间距是0.5-0.8cm；所述底板的宽度是0.3-0.5cm。作为优选，本专利技术所采用的吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。一种基于上述的人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：1)结合垫的制备：1.1)重组P6-His融合蛋白的制备、纯化：1.1.1)对人流感嗜血杆菌表面蛋白P6进行生物信息学分析，获取其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段；1.1.2)找到步骤1.1.1)中所得到肽段对应的基因编码序列，并在序列的5’端及3’端引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记为P6；其序列参见序列表；1.1.3)将步骤1.1.2)中所得到的P6按分子生物学方法克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组P6-His融合蛋白；所述重组P6-His融合蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中；1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.3)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0.2mg/mL后备用；1.2)兔及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白多克隆抗体IgG的制备：1.2.1)以步骤1.1.4)中所得到的重组P6-His融合蛋白为完全抗原，分别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清；所述兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×105；1.2.2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；1.2.3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.2.2)所得到的二种多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为3mg/mL后备用；1.3)量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针的制备与纯化：1.3.1)向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺和300nmol碳二亚胺，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm，37℃反应30min后，透析去除过量的N-羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；1.3.2)在活化的量子点中，加入4-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡，其特征在于：所述人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针；所述检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白多克隆抗体；所述质控线包被有抗兔IgG；所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。

【技术特征摘要】
1.一种基于人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：1)结合垫的制备：1.1)重组P6-His融合蛋白的制备、纯化：1.1.1)对人流感嗜血杆菌表面蛋白P6进行生物信息学分析，获取其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段；1.1.2)找到步骤1.1.1)中所得到肽段对应的基因编码序列，并在序列的5’端及3’端引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记为P6；所述P6的全基因序列是：CATATGTACAACACCGTATATTTTGGTTTTGATAAATACGACATCACCGGTGAATACGTTCAAATCTTNdeIAGATGCGCACGCAGCATATTTAAATGCAACGCCAGCTGCTAAAGTATTAGTAGAAGGTAATACTGATGAACGTGGTACACCAGAATACAACATCGCATTAGGACAACGTCGTGCAGATGCAGTTAAAGGTTATTTAGCAGGTAAAGGTGTTGATGCTGGTAAATTAGGCACAGTATCTTACGGTGAAGAAAAACCTGCAGTATTAGGTCACGATGAAGCTGCATATTCTAAAAACCGTCGTGCAGTGTTAGCGTACTAACTCGAGXhoI1.1.3)将步骤1.1.2)中所得到的P6按分子生物学方法克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组P6-His融合蛋白；所述重组P6-His融合蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中；1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.3)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0.2mg/mL后备用；1.2)兔及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白多克隆抗体IgG的制备：1.2.1)以步骤1.1.4)中所得到的重组P6-His融合蛋白为完全抗原，分别免疫新西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清；所述兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×105；1.2.2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG；1.2.3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.2.2)所得到的二种多克隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为3mg/mL后备用；1.3)量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针的制备与纯化：1.3.1)向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺和300nmol碳二亚胺，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm，37℃反应30min后，透析去除过量的N-羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为：2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲液的pH＝7.3；1.3.2)在活化的量子点中，加入4-12nmol的步骤1.2)所制备的兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇至终浓度为1.5％，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；用0.2μmPES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物；收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4℃下离心15min，收集超滤管...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡征，杨波，董俊，
申请(专利权)人：董俊，
类型：发明
国别省市：湖北;42