【技术实现步骤摘要】
人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学检测
,具体为一种人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用。
技术介绍
流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae,Hi)是感染人类的一种重要的呼吸道病原微生物,该菌由波兰细菌学家费佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中发现的,在随后的时间里被研究者们广泛研究。现仅知人是该病原体的宿主。免疫力较差的老人和儿童为易感人群,特别是5岁以下的婴幼儿。Hi可引发肺炎、结膜炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等,在全球每年至少有300万严重病例发生,可造成患儿致残甚至死亡。Hi分为有荚膜的a、b、c、d、e、f共6个血清型和无荚膜的不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilusinfluenzae,NTHi),一度以荚膜b型Hi最为流行。目前我国开展的Hi血清学检查大多也只针对侵袭力较强的荚膜b型。而由于该型菌株荚膜多糖疫苗的成功研发与应用,其流行已被有效控制。近来的研究多显示,在感染Hi的患者中最常见的菌株是NTHi,其分离率已达50%以上。临床上由于Hi与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似,因此常难以根据临床表现、x-射线检查等得出结论,确诊往往依赖于实验室诊断。婴幼儿疾病的特点是起病急、转归快,因此敏感、快速、实用的Hi检测对及早进行有效的临床干预具有非常重要的意义。尽管流感嗜血杆菌在全球范围内传播,但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前,Hi感染的诊断方法有血清学检测法,核酸检测法和病原体直接检测法。检测血清中HiIgG、IgA、I ...
【技术保护点】
一种人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡,其特征在于:所述人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫;所述结合垫包被有量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针;所述检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成;所述检测线包被有鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白多克隆抗体;所述质控线包被有抗兔IgG;所述检测层粘贴在底板上;所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起;所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。
【技术特征摘要】
1.一种基于人流感嗜血杆菌量子点免疫层析检测卡的制备方法,其特征在于:所述制备方法包括以下步骤:1)结合垫的制备:1.1)重组P6-His融合蛋白的制备、纯化:1.1.1)对人流感嗜血杆菌表面蛋白P6进行生物信息学分析,获取其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段;1.1.2)找到步骤1.1.1)中所得到肽段对应的基因编码序列,并在序列的5’端及3’端引入酶切位点并化学合成全基因序列,同时标记为P6;所述P6的全基因序列是:CATATGTACAACACCGTATATTTTGGTTTTGATAAATACGACATCACCGGTGAATACGTTCAAATCTTNdeIAGATGCGCACGCAGCATATTTAAATGCAACGCCAGCTGCTAAAGTATTAGTAGAAGGTAATACTGATGAACGTGGTACACCAGAATACAACATCGCATTAGGACAACGTCGTGCAGATGCAGTTAAAGGTTATTTAGCAGGTAAAGGTGTTGATGCTGGTAAATTAGGCACAGTATCTTACGGTGAAGAAAAACCTGCAGTATTAGGTCACGATGAAGCTGCATATTCTAAAAACCGTCGTGCAGTGTTAGCGTACTAACTCGAGXhoI1.1.3)将步骤1.1.2)中所得到的P6按分子生物学方法克隆入表达载体pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组P6-His融合蛋白;所述重组P6-His融合蛋白以可溶性表达方式存在于菌体中;1.1.4)用镍柱纯化步骤1.1.3)所得到的重组蛋白,SDS-PAGE检测其纯度后,以Bradford法测定蛋白质浓度,调整蛋白浓度为0.2mg/mL后备用;1.2)兔及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白多克隆抗体IgG的制备:1.2.1)以步骤1.1.4)中所得到的重组P6-His融合蛋白为完全抗原,分别免疫新西兰大白兔及豚鼠;分别制备兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清;所述兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于1×105;1.2.2)采用ProteinG亲和层析柱分别纯化兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清及鼠抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG;1.2.3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1.2.2)所得到的二种多克隆抗体IgG的浓度,将其蛋白浓度均调整为3mg/mL后备用;1.3)量子点标记的抗人流感嗜血杆菌纳米探针的制备与纯化:1.3.1)向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmolN-羟基琥珀酰亚胺和300nmol碳二亚胺,以磷酸盐缓冲液定容为2ml,于旋转混合仪中,以15rpm,37℃反应30min后,透析去除过量的N-羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺;所述磷酸盐缓冲液中各组分含量分别为:2.9g/L磷酸氢二钠、0.295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠,所述磷酸盐缓冲液的pH=7.3;1.3.2)在活化的量子点中,加入4-12nmol的步骤1.2)所制备的兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白多克隆抗体IgG,避光反应2h,加入端氨基化聚乙二醇至终浓度为1.5%,封闭未反应的活化羧基位点,继续避光反应1h;用0.2μmPES滤器过滤除去抗体聚集物,然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中,以8000g离心力在4℃下离心15min,除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物;收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液,溶于2ml磷酸盐洗涤液中,再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中,以8000g离心力在4℃下离心15min,收集超滤管...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。