本发明专利技术公开了一种用于H7亚型禽流感病毒检测的HA基因环介导等温扩增试剂盒及其使用方法。所述试剂盒，其特征在于，由H7亚型禽流感病毒HA基因环介导等温扩增引物混合液、环介导等温扩增反应预混液、H7亚型禽流感病毒阳性及阴性质控品构成。所述引物组，其特征在于，由H7亚型禽流感病毒HA基因保守区域设计而成，包括一对内引物（FIP，BIP）、一对外引物（F3，B3）和一对环引物（LF，LB），可用于直接荧光目视方法、紫外光照射荧光目视方法、凝胶电泳方法、实时荧光检测方法、实时浊度检测方法及微全分析方法。本发明专利技术提供了一种用于家禽H7亚型禽流感病毒快速检测技术手段，特异性强，灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一套用于病毒快速检测的引物组、试剂盒及使用方法，尤其涉及一套 用于检测H7亚型禽流感病毒的环介导等温扩增引物组、试剂盒及其使用方法，属于H7亚型 禽流感病毒检测领域。
技术介绍
甲型流感病毒为常见流感病毒，对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型 流感病毒属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae)甲型流感病毒属（InfluenzavirusA)，其基 因组为八个分节段的负链RNA，共编码12~13种蛋白，根据两种表面蛋白血凝素（HA)和神 经氨酸酶（NA)可分为不同的血清型。目前已从甲型流感病毒的天然宿主水禽中分离到16 种HA与9种NA亚型的甲型流感病毒。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病 毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2 和H10N8。 禽流感（Avianinfluenza)是一种由甲型流感病毒引起的禽类急性、热性、败血性 的传染病，属法定的一类传染病。根据禽流感病毒（AIV)对禽类致病性的不同，AIV可以分 为低致病性禽流感病毒（LPAIV)和高致病性禽流感病毒（HPAIV)。高致病性禽流感对禽类 具有高度致死性，是严重危害养禽业的烈性传染病。该病极易在禽鸟间散播，可引致家禽大 量死亡，对家禽业带来不可估量的破坏，发生之时会造成巨大的经济损失。由于病毒基因变 异后能够感染人类，所以禽流感是一种人兽共患的烈性传染病。人感染后的症状主要表现 为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡， 病死率很高。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播。 近年来，引起家禽爆发禽流感的高致病性和低致病性H7亚型禽流感病毒株包括 H7N1、H7N2、H7N3、H7N4和H7N7亚型，导致7500万只家禽被扑杀。值得注意的是，受到禽 类H7亚型病毒影响的国家包括中国、巴基斯坦、澳大利亚、爱尔兰、意大利、加拿大、德国、 智利、荷兰、墨西哥、英国和美国等，其中中国、加拿大、美国、荷兰、意大利、墨西哥和英国都 有人的感染病例，从某种程度上说这些亚型的病毒给全球公共卫生带来巨大风险。特别是 自2013年3月以来爆发的人感染H7N9禽流感，截至2014年10月24日，已造成我国包括 台湾和香港在内的15个省市454人感染，其中176人死亡。由于H7亚型具有高致病性， 又由于感染人的H7亚型病毒存在极大的多样性，因此对禽类H7亚型禽流感病毒的检测，以 及对H7亚型禽流感病毒暴露人群，包括农场工人、参与家禽捕杀者及其家属以及处理H7病 毒疫情的相关医务人员进行主动监测是十分必要的。 环介导等温扩增（LAMP)法是2000年由日本Notomi博士专利技术的一种新的核酸扩增 技术。其基本原理在于利用4-6个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒 温条件下对靶序列进行扩增。RT-LAMP技术具有特异性强、敏感性高、反应迅速、设备要求低 等特点。该方法经过十几年的发展，得到不断完善，尤其在结果判定方面，已有多种肉眼可 视的方法及实时荧光检测法得到广泛应用，可从源头上控制住由电泳开盖造成的气溶胶污 染，尤其适合于现场快速检测以及床旁检测。本专利技术建立了一套H7亚型禽流感病毒HA基 因环介导等温扩增试剂盒及检测方法，为H7亚型禽流感病毒的检测及调查分析提供了一 种新的简便、快速的途径。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一套用于H7亚型禽流感病毒快速检测的环介导等温扩 增引物组，由H7亚型禽流感病毒HA基因环介导等温扩增引物组构成，可用于检测H7亚型 禽流感病毒的环介导等温扩增反应。 所述H7亚型禽流感病毒HA基因环介导等温扩增引物组是通过大量比对Genbank 中下载的不同种H7亚型禽流感病毒的HA基因核酸序列，针对保守区片段序列所设计。 其中，HA基因引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，内引物与外引物按 6:1-12:1的比例配制成，优选比例为8:1，环引物与内引物的比例为1:2。 所述的环介导等温扩增反应预混液，可以是使扩增产物发出荧光信号的一种商品 化试剂盒IsothermalMasterMix或者等效的其他试剂盒，由Bst聚合酶、dNTP、甜菜碱、MgSOjll缓冲溶液组成。如模板为RNA，还需加入逆转录酶如AMVreversetranscriptase 或者等效的其他逆转录酶。试剂盒中还同时引入一组H7亚型禽流感病毒阳性质控品和阴 性质控品。所述H7亚型禽流感病毒阳性质控品，可以是由H7亚型禽流感病毒HA基因人工 合成目的片段的重组质粒或其体外转录RNA构成。所述阴性质控品，为不含H7亚型禽流感 病毒基因组片段的介质。 所述H7亚型禽流感病毒HA基因环介导等温扩增反应体系的总体积为25μL， 其中包括HA基因环介导等温扩增引物组溶液6μL，环介导等温扩增反应预混液14μL， 待测试样、阳性或者阴性质控品各5μL;环介导等温扩增荧光检测系统的扩增程序为： 義:65Γ，30-60π?η，蒙98Γ-80Γ，0· 05Γ/s，10min。 所述的H7亚型禽流感病毒HA基因检测试剂盒，实时荧光检测法中每个反应荧光 信号达最大值所对应的扩增时间与H7亚型禽流感病毒HA基因模板质粒的拷贝数（copies) 对数值之间，在10拷贝/反应-107拷贝/反应范围内具有线性关系，R2多〇. 990 ;该方法 HA基因的检出限可达到单拷贝模板质粒。 扩增结果的分析和判定方法包括： 1)环介导等温扩增荧光检测系统测得的扩增曲线平台荧光值高于本底噪音信号5倍 且溶解曲线为单一峰的判定为阳性结果，扩增曲线平台荧光值低于本底噪音信号5倍的判 定为阴性结果，扩增曲线平台荧光值高于本底噪音信号5倍但溶解曲线不是单一峰的判定 为非特异性的交叉干扰信号。 2)当待测试样HA基因环介导等温扩增反应管全部为阴性结果时，则未检测到H7 亚型禽流感病毒；待测试样为阳性结果，则有H7亚型禽流感病毒感染；HA基因的扩增曲线 以30min时的读数为基准。【附图说明】 图1实时荧光检测法H7亚型禽流感病毒HA基因引物特异性实验结果。 (a)实时荧光扩增曲线，（b)实时荧光溶解曲线 图2荧光信号达最大值所对应的扩增时间与H7亚型禽流感病毒模板质粒拷贝数对数 值间的关系曲线。 (a)实时荧光扩增曲线，（b)函数关系曲线 具体实施方法 下面结合附图，对本专利技术的具体实施方法做进一步详细描述，本专利技术的优点和特点将 会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制， 本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。 实施例 1.试验材料与方法 1. 1试验材料 接种H7亚型禽流感病毒HA基因质粒的大肠杆菌，160~180r、37°C、45度倾斜培养14 小时。提取质粒并测定浓度。 1.2当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一套用于H7亚型禽流感病毒检测的环介导等温扩增引物组，由其血凝素 (hemagglutinin, HA)基因环介导等温扩增引物组构成，其特征在于，可用于检测H7亚型禽流感病毒的环介导等温扩增反应；所述H7亚型禽流感病毒HA基因环介导等温扩增引物组，其特征在于，扩增序列在H7亚型禽流感病毒HA基因保守区选定，由一对外引物（SEQ No.1、SEQ No.2）、一对内引物（SEQ No.3、SEQ No.4）和一对环引物（SEQ No.5、SEQ No.6）组成，其引物序列为：引物名称引物序列（5’‑3’）SEQ No.1GCTGAAGAAGATGGCACTGSEQ No.2AAACATGATGCCCCGAAGSEQ No.3TGCTGTGATCATAGGTGTTATTTCT‑GTTGCTTTGAAATATTTCACAAGTGSEQ No.4TACAGGGAAGAGGCAATGCA‑AAGTATCACATCTTTGTAGCCGSEQ No.5ACTGGCCATACAGTCATCATCASEQ No.6TTGACCCAGTCAAACTAAGCAG如权利要求1所述的H7亚型禽流感病毒HA基因环介导等温扩增引物组，其特征在于，用于H7亚型禽流感病毒检测的方法包括：1）实时荧光检测法，其特征在于，使用环介导等温扩增荧光检测系统实现同步等温扩增并实时检测反应管中的荧光信号，获得等温扩增曲线和溶解曲线，进而判定检测结果；2）实时浊度检测法，反应时实时监测反应管中浊度信号，获得等温扩增曲线，进而判定检测结果；3）紫外照射荧光检测法，扩增反应后将反应管中反应液在紫外光下照射，呈红色荧光的检测为阳性结果，不呈红色的检测为阴性结果；4）直接荧光目测法，其特征在于，在扩增反应前向反应管中加入钙黄绿素作为荧光指示剂，可通过肉眼直接判定结果，反应管中反应液呈绿色的为阳性结果，不呈绿色的为阴性结果；5）凝胶电泳检测法，其特征在于，反应后反应液电泳时有特征梯形条带者为阳性结果，无特征梯形条带者为阴性结果；6）微全分析法或者微流控芯片法或者芯片实验室法，其特征在于，样品裂解、核酸提取纯化、等温扩增和检测均集成在微全分析系统上自动完成，结果判定方法包括前述的实时荧光检测法、实时浊度检测法、紫外照射荧光检测法、直接荧光目测法、凝胶电泳检测法，该微全分析系统由微膜片泵（阀）驱动，通过程序控制微膜片泵（阀）的开启与闭合实现微流体样品的驱动控制。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹明强，薛强，殷宏，刘新亮，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，中检国研北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。