本发明专利技术公开一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法。本发明专利技术通过联合传统蛋白提取的三氯乙酸/丙酮沉淀法和苯酚抽提法，同时引入助溶剂SDS溶液，并优化提取过程，建立了一种适合红树植物秋茄叶片总蛋白提取的Phe-B方法。本发明专利技术有效地提高了蛋白质的提取效率和质量，其技术方案可专门适合于双向电泳的秋茄叶片蛋白的提取。本发明专利技术方法具有操作简单、蛋白提取效率高、干扰物质少的特点，适合于蛋白提取困难、蛋白提取效率低、干扰物质多的材料。本发明专利技术所提取的秋茄叶片蛋白完全满足双向电泳第一向和第二向的要求，可获得分辨率高、蛋白点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的高质量双向电泳凝胶图谱，且实验重复性和稳定性好。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术涉及蛋白组学研究领域的一种红树植物蛋白提取与分离方法，具体涉及一 种稳定、高效的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法。
技术介绍
： 红树林是生长在热带、亚热带海湾、河口泥滩上特有的以红树植物为主体的常绿 灌木或乔木组成的海洋湿地生物群落，是重要的海洋湿地生态系统。红树林在防风消浪、护 堤固岸、促淤固滩、净化水体和维持沿海湿地生物多样性等方面具有重要作用和巨大的社 会经济效益。目前，全球极端天气气候对红树林的生存和发展产生了直接的影响，秋茄，作 为红树植物的常见物种，是抗寒性最强、分布最广的红树物种之一，如何从蛋白质水平上研 究红树植物秋茄对逆境的响应与适应机制对应对全球变化具有重要科学意义。 双向电泳是在蛋白水平上研究复杂基因表达非常有效的方法，为了获得好的结 果，高质量的蛋白样品制备是蛋白组学研究中最重要的步骤之一。然而，蛋白样品提取过程 中经常会发生共沉淀或其他非蛋白物质的污染。由于红树植物中常含有大量的其他物质， 如单宁、盐分、色素、多糖、多酸、脂类、淀粉、蛋白酶、细胞壁、液泡和其他刺激代谢产物等， 严重地影响了蛋白质的提取分离，并且红树植物中蛋白的含量相对较低，使蛋白的提取变 得更加困难。秋茄叶片组织中的这些干扰物质含量非常高，使得秋茄叶片蛋白的提取尤其 困难，如何获得高质量的蛋白对于秋茄蛋白组学的研究显得至关重要。 三氯乙酸-丙酮沉淀法（简称TCA-A法）是开展绝大多数植物蛋白组学研究最 基本的方法。TCA-A法已经成功用于不同的植物组织蛋白提取，如木材组织、玉米叶片等。 尽管TCA-A法可以增强蛋白的共沉淀作用，并有助于去除杂质，然而一些聚合物杂质也常 常一起被共沉淀；此外，TCA-A法的另外一个缺点就是蛋白被TCA-A沉淀后，蛋白不能完 全再溶解。在秋茄叶片蛋白组学研究中，TCA-A法提取的蛋白在双向电泳图上显示出了 明显的纵条纹和拖尾现象。蛋白提取的另一个常用基本方法就是苯酚提取法（简称Phe 法）。Phe法可以追溯到19世纪50年代。在一些植物蛋白提取中，苯酚被发现是一个能 将蛋白从水溶液中提取的有效试剂。然而，以往的研究表明，Phe法仍然不能很好地将干 扰物质从红树植物中去除，如秋前（Kandeliacandel) (Wang,L.G.，Liu,X.，Liang,M.，et al.Proteomicanalysisofsalt-responsiveproteinsintheleavesofmangrove Kandeliacandelduringshort-termstress.PlosOne, 2014b,9(1) :e83141. D01:10. 1371/journal.pone. 0083141)、木榄（Zhu，Z.，Chen，J.，Zheng，H.L.Physiological andproteomiccharacterizationofsalttoleranceinamangroveplant，Bruguiera gymnorrhiza(L·)Lam.TreePhysiology，2012, 32(11) : 1378-1388.)和红海榄（吉星，邓用 川，黄惜等.红海榄根部盐胁迫反应的比较蛋白质组学分析.中国生物化学与分子生物学 报，2009, 25(1) :72-77.)等。以往研究中用Phe法获得的蛋白进行的双向电泳图谱中，存 在着高背景值，这表明还是有很多干扰杂质的存在。目前，有关双向电泳在红树植物中的应 用报道还较少，尤其在红树植物蛋白组学研究中还没有很好的蛋白提取方法。
技术实现思路
： 本专利技术的目的是提供一种稳定、高效适用于双向电泳的秋茄叶片总蛋白的提取方 法，本方法操作简便、蛋白提取效率高、分离蛋白点多、杂质少、重复性好、图谱清晰、不干扰 第一向等电聚焦和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一套适用于秋茄叶片总蛋白的提取的有 效方法。 本专利技术的适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1)、取新鲜秋茄叶片剪碎后，每lg样品加入0.lg的PVPP(交联聚乙烯吡咯烷 酮），于研钵中用液氮充分研磨，将研好的粉末转移至预冷的离心管中；(2)、用TCA/丙酮对步骤⑴离心管中的粉末进行洗涤，每lg样品加入5ml预冷 的含质量体积比为10%TCA的丙酮，涡旋，充分震荡后离心，弃上清； (3)、用含有0. 1M醋酸铵的体积分数为80 %甲醇进行洗涤，充分混匀，使溶液pH值 达到7以上，离心后去除上清； (4)、加入体积分数为80%丙酮进行洗涤，充分涡旋后直到沉淀完全悬浮，离心后 去除上清； (5)、将沉淀真空干燥，以去除残留的丙酮； (6)、提取并沉淀蛋白：每lg样品加入8ml体积比为1:1的苯酌VSDS(十二烷基横 酸钠）缓冲液，其中，苯酚的pH值大于（或等于）7. 8,充分混匀并孵育，离心，将上层酚相转 移到新的离心管，加入5倍体积的含有0. 1M醋酸铵的甲醇，沉淀过夜，离心后弃上清，留沉 淀；(7)、用甲醇洗涤步骤(6)的沉淀一次，再用体积分数为80%丙酮和纯丙酮各洗涤 一次，在每一次洗涤步骤中，都要充分涡旋混匀，然后离心弃上清，留沉淀； (8)、吸干剩余的液体，并将沉淀摊开，真空干燥，得到蛋白干粉； (9)、将步骤⑶得到的蛋白干粉保存备用或进行蛋白裂解：向蛋白干粉中按 20μΙ/mg加入样品裂解液，使蛋白干粉充分浸润、混匀，孵育，期间不时地颠倒混匀，蛋白质 充分溶解，离心后所得的上清即为适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白。 步骤（6)所述的SDS缓冲液，优选，其配方为：30% (w/v)蔗糖，2% (w/v)SDS，0· 1M Tris-HCl(pH8. 0)，5% (ν/ν)β-巯基乙醇，ImMPMSF(苯甲基磺酞氟）。 步骤（6)所述的沉淀过夜，优选，温度为-20°C。 步骤（9)所述的样品裂解液，优选，其配方为：7M尿素，2M硫脲，4% (w/v)CHAPS(3 一 一丙磺酸），0· 2% (v/v)pH值为4-7的两性电解液，50mM DTT(二硫苏糖醇），2mMTBP(磷酸三丁酯），0.ImMPMSF。 步骤（9)所述的孵育，优选在35°C下孵育2h。 所述的两性电解液，优选为IPGbuffer。 通过以上步骤制备得到的红树植物秋茄叶片总蛋白可直接用于蛋白质定量 (Bradford法）或双向电泳分析或分装后存于-80 °C备用。 本专利技术的技术效果： (1)、在研磨样品的过程中加入适量的PVPP，有效增强了植物组织中多酚的去除；(2)、用含10%TCA的丙酮快速洗涤研磨后的植物粉末，有效增强了蛋白的沉淀作 用和杂质的去除（主要是脂类或类脂多聚物、酚类物），同时避免了蛋白长时间暴露低pH环 境（含TCA)下，减少了由此而引起的蛋白降解和修饰； (3)、用含10%TCA的丙酮洗完后增加了用含0. 1M醋酸铵的80%甲醇洗涤步骤， 这一步骤能有效地中和残余的TCA，使pH值增加至7以上，从而增强了后续苯酚对蛋白分离 提取的效率； (4)、苯酚与SDS溶液混合后作为提取蛋白的溶剂，不仅能有效去除蛋白中的盐 类、酸性杂质，还有效地增强了蛋白的溶解性，其中SDS是膜结合蛋白恢复非常有效的助溶 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、取新鲜秋茄叶片剪碎后，每1g样品加入0.1g的PVPP，于研钵中用液氮充分研磨，将研好的粉末转移至预冷的离心管中；(2)、用TCA/丙酮对步骤(1)离心管中的粉末进行洗涤，每1g样品加入5ml预冷含质量体积比为10％TCA的丙酮，涡旋，充分震荡后离心，弃上清；(3)、用含有0.1M醋酸铵的体积分数为80％甲醇进行洗涤，充分混匀，使溶液pH值达到7以上，离心后去除上清；(4)、加入体积分数为80％丙酮进行洗涤，充分涡旋后直到沉淀完全悬浮，离心后去除上清；(5)、将沉淀真空干燥，以去除残留的丙酮；(6)、提取并沉淀蛋白：每1g样品加入8ml体积比为1:1的苯酚/SDS缓冲液，其中，苯酚的pH值大于等于7.8，充分混匀并孵育，离心，将上层酚相转移到新的离心管，加入5倍体积的含有0.1M醋酸铵的甲醇，沉淀过夜，离心后弃上清，留沉淀；(7)、用甲醇洗涤步骤(6)的沉淀一次，再用体积分数为80％丙酮和纯丙酮各洗涤一次，在每一次洗涤步骤中，都要充分涡旋混匀，然后离心弃上清，留沉淀；(8)、吸干剩余的液体，并将沉淀摊开，真空干燥，得到蛋白干粉；(9)、将步骤(8)得到的蛋白干粉保存备用或进行蛋白裂解：向蛋白干粉中按20μl/mg加入样品裂解液，使蛋白干粉充分浸润、混匀，孵育，期间不时地颠倒混匀，蛋白质充分溶解，离心后所得的上清即为适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：费姣，王友绍，程皓，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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