热稳定的寡聚重组多肽，其呈现融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的至少一个抗原表位、包含RSV F蛋白胞外域、在HRB区域中经功能性删除、跨膜和胞质结构域被替换为异源三聚结构域、并且不存在两个功能性多碱性弗林蛋白酶切割位点，其可用作免疫原性组合物中的抗原性组分，所述免疫原性组合物可用于诱导针对RSV感染的免疫应答和疫苗接种的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】热稳定的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白寡聚物及其在免疫 组合物中的用途 专利
本专利技术涉及医药特别是疫苗的领域，并且更具体地，涉及可用于疫苗以针对呼吸 道合胞病毒（RSV)进行免疫的重组蛋白。 专利技术背景 人呼吸道合胞病毒（hRSV)导致急性上呼吸道和下呼吸道感染，并且是婴儿在出 生第一年中住院治疗的主要原因。RSV的再感染频繁发生并且消除性免疫从未稳固地建立。 RSV还在老年人中导致显著的疾病负担和死亡率，这堪比流感。hRSV是属于副粘液病毒科（Paramyxoviridae)的肺炎病毒亚科（Pneumovirinae) 的包膜负链RNA病毒。该亚科的其它成员为牛RSV(bRSV)和人偏肺病毒（hMPV)。hRSV 颗粒含有两个主要的糖蛋白（其是中和抗体的主要靶标）：附着蛋白G和融合蛋白F(综 述于CollinsPLandJAMelero. 2011.Progressinunderstandingandcontrolling respiratorysyncytialvirus:stillcrazyafteralltheseyears.VirusRes 162:80-99)。存在两种RSV血清型（A和B)，它们在其G蛋白中相比于F蛋白更为不同。F 蛋白相较于G蛋白似乎是更有效的中和及保护性抗原。这可能与G蛋白的高碳水化合物含 量相关，所述碳水化合物可保护蛋白不被免疫识别。此外，G蛋白还从被感染的细胞分泌， 在该形式下其可用作抗原诱饵。F蛋白不仅用于使病毒和宿主膜融合，还在病毒-细胞附着 中起着主要作用。因此靶向F的中和抗体可干扰病毒-细胞附着和/或病毒-细胞融合。RSVF蛋白是I型膜蛋白，其被合成为组装成三聚体的无活性前体蛋白（命名为 'F0'）。重组野生型RSVF编码基因的核苷酸序列提供为SEQIDN0:1，而编码的重组可 溶性野生型蛋白序列提供为SEQIDN0 :2。该前体蛋白在其运输通过分泌途径期间通过弗 林蛋白酶样蛋白酶切割为名为'F2'、'p27'和'F1'的形式。F2和F1的同源三聚体（其通 过二硫键共价连接）形成亚稳定融合前活性结构。F1含有七肽重复区A和B(称作为HRA 和HRB)、融合肽（FP)和跨膜（TM)结构域，后两者位于该分子的相对侧。在病毒-细胞附 着后，RSVF蛋白中的构象变化导致疏水性融合肽至宿主细胞膜中的插入。随后，该融合中 间体重折叠成高度稳定的融合后结构。该后一种结构的组装由六螺旋束（6HB)的组装决 定。此6HB包含反向平行构象的各单体的HRA和HRB，其结果是位于HRB下游的跨膜结构 域和位于HRA上游的融合肽被定位在相邻位置并实现病毒和宿主膜的融合。研究已阐明了 F蛋白以其融合后构象的结构（McLellanJS等人，2011.JVirol85:7788-96;SwansonKA 等人2011.ProcNatlAcadSciUSA108:9619-24)。最近，还阐明了F蛋白以其融合前构 象的结构（McLellan等人，2013Science340 (6136) :1113-7)。为了将F稳定在其所需的构 象，将该蛋白与融合前特异性中和抗体D25共表达（US2012/0070446)。共晶体结构显示， D25结合至三聚体顶端上被指定为抗原位点0的位点（图2)。D25与F的融合前形式的 结合区包括SEQIDN0 :2所示的野生型RSVF蛋白序列的氨基酸60-71 (F2区）和氨基酸 197-210 (F1 区）。这些区域分别对应于如McLellan等人，April2013.StructureofRSV fusionglycoproteintrimerboundtoaprefusion-specificneutralizingantibody. Science340:1113-7中的图3所述的氨基酸63-74和200-213。电子显微镜和竞争结合表 明，AM22(US2012/0070446)结合相同的抗原位点。 hRSV疫苗开发由于在1960年代测试的福尔马林灭活的病毒疫苗所获得灾难 性结果而受到困扰。已接种疫苗的儿童在之后天然感染RSV时，疾病严重程度和住院率 升高并且发生一些死亡病例。这种疫苗诱导的疾病增强的机制尚不完全清楚，但似乎与 中和抗体的低诱导和嗜酸性粒细胞的招募有关。紧接着这项工作，已探索了大量RSV疫 苗策略，其取得了不同的成功，这些疫苗策略包括活的减毒RSV株、亚单位疫苗和病毒载 体疫苗（GroothuisJR等人，2〇lLPreventionofseriousrespiratorysyncytial virus-relatedillness.I:Diseasepathogenesisandearlyattemptsatprevention. AdvTher28:91-109；HurwitzJL.2011.Respiratorysyncytialvirusvaccine development.ExpertRevVaccineslO: 1415-33)D 显然，成功的RSV疫苗应诱导保护性免 疫但不引起免疫病理学。 已报道的发展情况 目前，预防RSV介导的疾病的唯一可用选择是商购可得的RSV中和单克隆抗体 帕利珠单抗的被动施用。该产品被用作为RSV感染的预防法，并识别F蛋白中的高度保 守表位（BeelerJAandKvanffykeCoelingh. 1989.Neutralizationepitopesofthe Fglycoproteinofrespiratorysyncytialvirus:effectofmutationuponfusion function.JVirol63:2941-50;GroothuisJR等人，2011.Preventionofserious respiratorysyncytialvirus-relatedillness.II:Immunoprophylaxis.AdvTher 28:110-25)。然而，由于其高成本，帕利珠单抗的使用局限于被认为处在发生严重呼吸道疾 病的高风险中的婴儿。 尽管存在对于用于保护一般人群的疫苗的需求，但目前不存在可用的经批准的针 对RSV的疫苗。基于主要RSV中和抗原（其为F蛋白）的许多疫苗候选物由于稳定性、再 现性和效力的问题而失败了。 尽管已显示RSVF的融合后形式含有中和表位（McLellanJS等人，2011. Structureofrespiratorysyncytialvirusfusionglycoproteininthe postfusionconformationrevealspreservationofneutralizingepitopes. JVirol85:7788-96；SwansonKA等人，201LStructuralbasisforimmunization withpostfusionrespiratorysyncytialvirusfusionFglycoprotein(RSVF)to elicithighneutralizingantibodytiters.ProcNatlAcadSciUSA108:9619-24)，本文档来自技高网...
【技术保护点】
热稳定的寡聚重组多肽，其呈现融合前呼吸道合胞病毒F蛋白的至少一个抗原表位，所述多肽包含呼吸道合胞病毒F蛋白胞外域，从中功能性删除了HRB区域，并且从中删除了跨膜和胞质结构域并替换为异源三聚结构域，以及其中所述呼吸道合胞病毒F蛋白胞外域中的两个多碱性弗林蛋白酶切割位点被删除或突变，从而使所述弗林蛋白酶切割位点是缺陷性的。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·A·M·德哈恩，P·J·M·罗特尔，B·J·海捷玛，
申请(专利权)人：姆科希斯有限责任公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL
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