本发明专利技术涉及细胞内糖链抗原活检技术领域，尤其是一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法，通过双光子荧光标记抗体LP-IgG和硝酸纤维素膜包被的固相抗体Ab，使得在检测时，固相抗体通过抗原反应特异性捕获待测抗原，形成免疫复合物Ab·Ag，加入双光子荧光标记抗体LP-IgG，与免疫复合物充分反应后(LP-IgG·Ab·Ag)，经洗涤去除非特异性物质，即可检测判定结果；克服了传统糖链抗原的检测方法中的灵敏度和稳定性较差，操作步骤繁琐的缺陷，并且也使得检测试样不再局限于血液和外周血，只要带有糖链抗原的试样即可用该双分子荧光标记探针LP制备成的试剂盒来进行检测。
【技术实现步骤摘要】
一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法
本专利技术涉及细胞内糖链抗原活检
，尤其是一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法。
技术介绍
糖链抗原(Carbohydrateantigen19-9，CA19-9)是一种与胰腺癌、胆囊癌、结肠癌和胃癌相关的肿瘤标识物，其单克隆抗体为1116NS19-9，简称Ab19-9；糖链抗原(Carbohydrateantigen125，CA125)是一种与卵巢癌、输卵管腺癌、子宫内膜癌和宫颈癌相关的肿瘤标识物，其单克隆抗体为OC125，简称Ab125。CA19-9测定广泛用于结肠直肠癌胃癌、胰癌、肝细胞癌肺癌、乳癌的临床监测与诊断；而CA125测定则广泛用于卵巢癌、输卵管腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌和乳腺癌的临床监测与诊断。因此，对于检测体内糖链抗原需要一种快速、专一、可靠的检测方法，并且这种快速、专一、可靠的检测方法也是早期肿瘤或癌症的诊断和预警的有效途径之一。现有技术中，对于糖链抗原的检测，其采用的方法较多，但由于这些方法的灵敏度和稳定性较差，并且在进行检测操作时较为繁琐，检测的试样仅限于血液与外周血，进而逐步在糖链抗原检测领域受到了局限性，造成早期肿瘤或癌症的诊断和预警的结果不理想。免疫荧光法，其特异性强、灵敏度高、速度快，与放射免疫法相比，无放射污染，操作简便；由于单光子荧光激发波长一般在350～560nm,易产生光致毒与光漂白；因此，在免疫荧光法中得到较大程度应用的是双光子荧光。但是，将双光子荧光应用于肿瘤或者癌症标志物的糖链抗原的活检，还未见有任何文献报道。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术提供一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法。双光子荧光采用800～1100nm的高强度激光作为激发光源,不仅能克服单光子荧光的缺点,还能实现深层暗场成像与定点激发,避免组织自发荧光干扰以及降低组织吸光系数,从而显著地提高成像的清晰度、检测的灵敏度与分辨率。本专利技术以[MoralesAR,YanezCO,Schafer-HalesKJ,MarcusAI,BelfieldKD.Biomoleculelabelingandimagingwithanewfluorenyltwo-photonfluorescentprobe.BioconjugateChem.,2009,20:1992–2000]为参考文献，将该文献中制备的双光子荧光探针LP标记抗-糖链抗原单克隆抗体-IgG，并将其借助免疫特异性亲合识别原理与双光子诱导荧光机制实现肿瘤标志物糖链抗原的实时动态活检。其中双光子荧光探针LP的合成步骤以及合成过程是按照上述的参考文献进行合成，其中的反应的分子结构式为：其中得出的双光子荧光探针LP为黄色固体物质(m.p.217～218℃)。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ:8.134(dd，6H，Ph-H)，7.933(d，2H，Ph-H)，7.721(t，6H，4H，CH＝CH，and4H，Ph-H)，7.615(s，2H，Ph-H)，7.584(d，2H，Ph-H)，7.521(t，2H，Ph-H)，7.413(t，2H，Ph-H)，7.335(m，4H，Ph-H)，3.232(m，7H，OCH2，CH3)，2.884(t，2H，OCH2)，2.765(s，4H，CH2)，2.581(m，4H，CH2)，1.953(m，2H，CH2)。13CNMR(125MHz，CDCl3)δ:170.545(C＝O)，167.416(Ar-C＝N)，157.103，154.175，149.362，140.854，140.513，137.075，135.014，132.236，131.352，128.264，127.853，127.317，123.425，122.971，121.773，71.852，69.921，58.764，55.735，52.606，48.344，34.236，26.224，25.382。元素分析(％，C55H45N3O6S2计算值)：C72.71(72.74)，H5.06(4.99)，N4.68(4.63)，O10.53(10.57)，S7.01(7.06)；HRMS(EI)(C55H45N3O6S2计算值)，m/z：907.2753(907.2750)。本专利技术的技术方案主要是将结构式为：的双光子荧光标记探针LP用于细胞内糖链抗原活检。其在用于细胞内糖链抗原活检的过程中包括有直接法和间接法，直接法是将抗原采用稀释缓冲液稀释至一定的浓度；再将稀释好的抗原滴加在固相载体上，以封闭缓冲液覆盖无抗原的区域，进而避免荧光指示剂的非特异性吸附；再将双光子荧光指示剂稀释至实验所需要的浓度，按照包被、封闭、一次洗涤、点样、二次洗涤、荧光标记示踪、三次洗涤、检测的步骤标记抗体，并稀释至一定的浓度；再滴加双光子荧光标记抗体LP-Ab样品至固定有抗原的固相载体上，温育，以使抗原抗体结合，与免疫复合物充分反应后；再洗涤缓冲液冲洗固相载体三次，去除未结合样品及荧光指示剂；在双光子荧光显微镜下进行定性/定量观察。间接法是用稀释缓冲液将抗原稀释至一定浓度；将稀释好的抗体Ab滴加至固相载体上，以封闭剂覆盖无抗原区域，避免荧光指示剂的非特异性吸附；；使用稀释缓冲液将样品稀释至一定浓度；将处理好的样品滴加至固定有抗体的固相载体上，温育，以使抗原抗体结合，形成Ab·Ag；再将双光子荧光标记抗体LP-IgG滴加至抗原抗体结合后的固相载体上，以使之与抗体结合，形成LP-IgG·Ab·Ag；再以洗脱缓冲液冲洗固相载体三次，去除未结合样品及荧光指示剂；在双光子荧光显微镜下进行定性/定量观察。本专利技术的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其由双光子荧光标记探针LP、抗糖链抗原单克隆抗体-Ab、硝酸纤维素膜、抗糖链抗原单克隆抗体-IgG、阳性对照品、阴性对照品、封闭缓冲液和洗涤缓冲液组成；其中，所述的封闭缓冲液是pH为7.4，摩尔浓度为20mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0.5％的BSA；所述的洗涤缓冲液是pH为7.4，摩尔浓度为50mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0.05％的吐温20；上述的荧标试剂盒用于细胞内糖链抗原活检的方法，包括以下步骤：(1)包被：在硝酸纤维素膜上滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab，一滴一点，各点间相隔1-2cm，并滴加完成后，置于温度为4℃环境中，吸附0.5-1h；(2)封闭：将步骤(1)包被完成的硝酸纤维素膜浸入封闭缓冲液中，在37℃下温育0.5-2h；(3)一次洗涤：将步骤(2)封闭完成的硝酸纤维素膜采用洗涤缓冲液清洗至少三次，静置干燥；(4)点样：向步骤(3)一次洗涤完成的硝酸纤维素膜按照步骤(1)滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab形成的点滴加阳性样品、阴性样品和待测样品，其中阳性样品、阴性样品和待测样品滴加的点的个数相等，每点滴加2-6uL；(5)二次洗涤：待步骤(4)滴加的样品液完全渗入硝酸纤维素膜后，室温静置10-30min，采用洗涤缓冲液清洗膜片至少三次，静置干燥；(6)荧光标记示踪：向步骤(5)处本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针，其特征在于，该双光子荧光探针为双光子荧光标记探针LP，结构式为：
【技术特征摘要】
1.一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，其由双光子荧光标记探针LP、抗糖链抗原单克隆抗体-Ab、硝酸纤维素膜、抗糖链抗原单克隆抗体-IgG、阳性对照品、阴性对照品、封闭缓冲液和洗涤缓冲液组成；其中，所述的封闭缓冲液是pH为7.4，摩尔浓度为20mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0.5％的BSA；所述的洗涤缓冲液是pH为7.4，摩尔浓度为50mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0.05％的吐温20；双光子荧光标记探针LP，结构式为：该荧标试剂盒用于细胞内糖链抗原活检的方法，包括以下步骤：(1)包被：在硝酸纤维素膜上滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab，一滴一点，各点间相隔1-2cm，并滴加完成后，置于温度为4℃环境中，吸附0.5-1h；(2)封闭：将步骤(1)包被完成的硝酸纤维素膜浸入封闭缓冲液中，在37℃下温育0.5-2h；(3)一次洗涤：将步骤(2)封闭完成的硝酸纤维素膜采用洗涤缓冲液清洗至少三次，静置干燥；(4)点样：向步骤(3)一次洗涤完成的硝酸纤维素膜按照步骤(1)滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab形成的点滴加阳性样品、阴性样品和待测样品，其中阳性样品、阴性样品和待测样品滴加的点的个数相等，每点滴加2-6uL；(5)二次洗涤：待步骤(4)滴加的样品液完全渗入硝酸纤维素膜后，室温静置10-30min，采用洗涤缓冲液清洗膜片至少三次，静置干燥；(6)荧光标记示踪：向步骤(5)处理完成的膜片上加入双光子荧光标记抗体LP-IgG，加入量为每点滴加2-6uL，在37℃下温育处理0.5-2h；(7)三次洗涤：将步骤(6)处理好的膜片采用洗涤缓冲液清洗至少三次，取出膜片，去除表面残余液体；(8)检测：将硝酸纤维素膜平铺在玻璃片上，在双光子荧光显微镜下检测。2.如权利要求1所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄池宝，曾伯平，刘其斌，张道海，
申请(专利权)人：遵义师范学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。