一种鸡新城疫、传染性支气管炎病毒同胚培养的方法技术

一种鸡新城疫、传染性支气管炎病毒同胚培养的方法，属于兽用生物制品技术领域。该方法采用鸡新城疫病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，用鸡传染性支气管炎病毒稀释液稀释鸡支气管炎病毒至5000-10000倍，分别在4℃孵育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒混合病毒液。按本发明专利技术方法培养收获的病毒液提高了同胚培养的稳定性，大大降低了批次间差异，为后续疫苗生产工艺提供了优质的抗原液。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品
，具体设及一种鸡新城疫、传染性支气管炎病 毒同胚培养的方法。
技术介绍
新城疫（Newcastledisease,ND)是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus, NDV)引起的一种烈性病毒性传染病，是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一，也是我 国所有鸡病中危害最大的一种，被国际兽疫局（OIE)列为A类传染病。 鸡传染性支气管炎（IB)，是由传染性支气管炎病毒（IBV)引起的鸡的一种急性、 高度接触性传染的病毒性疾病，W气管罗音、咳嗽、打喷暧为主要特征，是危害养鸡业的主 要疫病之一。鸡传染性支气管炎的血清型众多，目前已报道的血清型有30余种，不同血清 型毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，相互间没有或仅有部分交叉免疫性， 同时新的血清型不断出现，给IBV的预防带来了诸多困难。 二联疫苗的制备，可W-针防治两种传染病，同时可W解决使用多种疫苗分次免 疫，造成的鸡群的其它的不良反应，简化免疫程序，降低投入的成本。 目前病毒的培养有动物接种、组织培养和鸡胚培养3种方法。其中鸡胚培养是病 毒培养中最常用的方法之一。鸡胚是正在发育中的机体，多种动物病毒能在鸡胚中增殖和 传代。鸡胚的优点在于胚胎的组织分化程度低，而且可W选择不同的日龄和接种途径，病毒 在鸡胚中易于增殖，部分病毒感染鸡胚W后可W产生豆瓣，引起充血、出血、坏死灶和死亡 等特异性的感染指征。感染病毒的鸡胚组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且 来源充足，设备和操作简便易行。 当前国内生产的新城疫、鸡传染性支气管炎疫苗基本都是采用鸡胚接种病毒后进 行增殖，收获尿囊液制备而成。传统的二联疫苗均由单一疫苗分别生产后混合在一起制成 二联疫苗，该工艺费时费力，生产成本较高。同胚培养是近年来兽用生物制品行业提出的生 产工艺，即将两种病毒W合适的比例混合后同时接种到鸡胚中进行增殖，该工艺减少了生 产工艺环节，缩短的生产周期，减少人力物力投入，大大降低了生产成本。但是截至到目前 为止同胚培养的工艺仍存在缺陷，培养过程中由于病毒之间的互相干扰，两种病毒的含量 均不稳定，批次间差异较大，困扰着该品种的生产，严重影响了后期疫苗的品质。 氨基酸，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质 的基本物质。维生素是维持机体生命活动必须的一类有机物质，也是保持机体健康的重要 活性物质。维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子，维生素是维持和调节机体正常代谢 的重要物质。在体内砸和维生素E协同，能够保护细胞膜，防止不饱和脂肪酸的氧化。多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作 为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的 各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶 活性和抑制脂质过氧化的能力。但是中药多糖的作用并不具有广谱性，同常某种或某几种 多糖协同作用具有特异性的活性作用。 本专利技术基于上述技术背景，提出一种同胚培养的方法，具体是一种特别适用于鸡 新城疫、传染性支气管炎病毒同胚培养的方法，解决了新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒 同胚培养稳定性差、批次间差异大的培养难题，提高了两种病毒的稳定性、收获量和病毒滴 度。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种鸡新城疫、传染性支 气管炎病毒同胚培养的方法的技术方案，通过该方法，可同时提高两种病毒的稳定性、收获 量和病毒滴度。 所述的，其特征在于采用鸡 新城疫病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000-5000倍，用鸡传染性支气管炎病毒稀释液稀释 鸡支气管炎病毒至5000-10000倍，分别在4°C解育30-60分钟后按1:1比例混合均匀，接种 9-10日龄鸡胚，0. 1-0. 15ml/胚，36-37°C继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收 获48-96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒混合病毒液。 所述的，其特征在于所述的 鸡新城疫病毒稀释液为每1000 ml憐酸缓冲液中含有W下重量配比的组分：氨基酸组合3~ 5g、维生素组合6~lOg、亚砸酸钢0~IOmg和复方中药多糖30~lOOg。所述的，其特征在于所述的 鸡传染性支气管炎病毒稀释液为每1000 ml憐酸缓冲液中含有W下重量配比的组分：氨基 酸组合2~6g、维生素组合4~8g、亚砸酸钢0~IOmg和复方中药多糖20~60邑。 所述的，其特征在于所述的 鸡新城疫病毒稀释液和鸡传染性支气管炎病毒稀释液的pH为6. 6~7。 所述的，其特征在于所述的 氨基酸组合含有W下重量百分比含量的氨基酸：苯丙氨酸10~50%、脫氨酸20~40%和亮 氨酸30~60%，所述的维生素组合含有W下重量百分比的维生素：维生素B2 15~40%、维 生素D20~50%和维生素E20~40%。 所述的，其特征在于所述的 复方中药多糖由赤巧、丹参、白薇、商陆和虫草提取得到，具体通过W下步骤得到： 按W下步骤制得： a、 按赤巧20~40份、丹参5~20份、白薇10~30份、商陆5~20份和虫草10~30 份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至 90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟揽拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室溫冷却后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收集上 清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； t用灭菌纯化水洗涂C中粗制中药多糖，洗涂后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉 淀，收集上清； e、 将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、 将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉。所述的，其特征在于所述的 氨基酸组合包括W下重量百分比的氨基酸：蛋氨酸20~30%、色氨酸20~40%、酪氨酸10~ 30%，亮氨酸10~30%，所述的维生素组合包括W下重量百分比的维生素：维生素B2 15~ 40%、维生素D20~50%和维生素E20~40〇/〇。所述的，其特征在于所述的 复方中药多糖由仙茅、杜仲、巧等和续断提取得到，具体通过W下步骤得到： a、 按仙茅10~30份、杜仲10~20份、巧等20~40份和断续5~20份称取各中药 原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90°C，并保持 在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟揽拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室溫冷却后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉淀，收集上 清； C、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖； t用灭菌纯化水洗涂C中粗制中药多糖，洗涂后用20倍量的42°C灭菌纯化水进行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附过夜，吸附后经1000化pm离屯、10分钟，弃去沉 淀，收集上清； e、 将d中上清液进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液； f、 将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥制得复合中药多糖冻干粉。 所述的，其特征本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡新城疫、传染性支气管炎病毒同胚培养的方法，其特征在于采用鸡新城疫病毒稀释液稀释新城疫病毒至1000‑5000倍，用鸡传染性支气管炎病毒稀释液稀释鸡支气管炎病毒至5000‑10000倍，分别在4℃孵育30‑60分钟后按1:1比例混合均匀，接种9‑10日龄鸡胚，0.1‑0.15ml/胚，36‑37℃继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48‑96小时死活胚液，既得鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒混合病毒液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建军，张秀文，李阳，
申请(专利权)人：浙江美保龙生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33