大豆锈菌(P.pachyrhizi)蛋白效应子的识别及其在产生亚洲大豆锈病(ASR)抗性植株中的用途制造技术

本发明专利技术涉及来自ASR的新型核酸及其所编码的多肽以及增强植物防御性诱发响应的使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】大豆诱菌（P.pachyrhizi)蛋白效应子的识别及其在产生 亚洲大豆诱病（ASR)抗性植株中的用途 对W电子方式提交的序列表的引用 通过EFS-WebW电子方式将序列列表的正式文本作为ASCII格式的序列列表提 交，该文件名称为"5414W0PCT_Sequence_Listing"，并且该文件与本说明书同时提交。该 ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文W引用的方式并入本文。
本专利技术设及植物生物
，特别是对亚洲大豆诱病的抗性。 背景 阳0化]亚洲大豆诱病（ASR)是一种由大豆诱菌（Phakopsorapachyrhizi)真菌引起的严 重的病害。大豆诱病由风媒的抱子散播，并且在世界上的许多大豆种植地区造成过显著的 作物损失。美国农业部扣SDA)的动植物卫生检验局（APHI巧于2004年11月10日宣布了 在美国大陆（路易斯安那）首例确诊的亚洲大豆诱病，紧接着在另外的8个南方州也有发 现。在2005年，大豆诱病在佐治亚州的29个县、南卡罗莱纳州的23个县、阿拉己马州的21 个县、北卡罗莱纳州的18个县、佛罗里达州的12个县、密西西比州的2个县W及路易斯安 那州的一个县的大豆上得到确诊。 取决于生长地区、流行病暴发时间和环境条件，受害农田的作物损失估计在 10-90%的范围内。目前市面上尚不存在对ASR有抗性的大豆。 因此，对能赋予亚洲大豆诱病抗性的组合物及方法有着持续的需求。【附图说明】 图1示出了 0 -葡糖巧酸酶和空载体共转化的大豆叶中0 -葡糖巧酸酶的活性 (图a)W及0-葡糖巧酸酶和候选ASR效应子化12(SEQIDNO:75)共转化的大豆叶中 0 -葡糖巧酸酶的活性（图b)。 图2示出了在表达病原体效应子AvrlkJcll(SEQIDNO:73)的大豆植株W及无 效应子的对照巧V=空载体）中相对于泛素表达的查尔酬合成酶表达。【具体实施方式】 植物病害是由生物和非生物原因引起的。生物原因包括真菌、病毒、细菌和线虫类 动物。植物病害的重要性的一个例子由植物病原真菌来说明：其引发显著的年度作物减产 和毁灭性的流行病。植物病害暴发所导致的灾难性作物歉收曾触发了饥荒并引发了重大的 社会变革。所有的约300, 000种有花植物均可遭受病原真菌的攻击，然而，单一植物物种仅 能作为几个真菌物种的宿主，而类似的，大多数真菌通常具有有限的宿主范围。一般来说， 植物病害防治的最佳策略是采用植物育种者针对此目的选育的抗病品种。然而，严重的作 物病害流行的可能性在今天依然持续存在，正如维多利亚燕麦疫病和南方玉米叶枯病的暴 发所证实的那样。作物保护的分子方法有可能实现抗病性的新机制，并且也可W较传统的 育种方法更快地实施。因此，有必要W分子方法来补充传统的育种方法从而保护植物免遭 病原体攻击。 细胞过程的宿主使植物自身能够抵御由致病因子引起的病害。运些防御机制在一 个所谓"诱发"的过程中由初始病原体侵染所激活。诱发时，宿主植物识别出一种称为"激 发子"的病原体衍生化合物，该植物随即启动致病基因的表达从而限制入侵生物体的进一 步扩散。通常认为：要克服运些植物防卫机制，植物病原体必须找到办法来抑制诱发并且克 服更多的具有物理基础的侵染障碍，诸如植物细胞壁的加固和/或细胞质膜附近的肌动蛋 白丝网络的重排。 因此，本专利技术通过一种能迅速融入商品作物中的具有分子基础的机制解决了对植 物防御性激发响应的增强的需求。 病原体分泌蛋白分子，运些蛋白分子要么集中在植物质外体，要么被植物细胞所 吸收。运些蛋白，称为效应子，可W具有无毒性或毒性功能。在前一种情况中，经由同源植 物R蛋白的识别启动宿主防御响应，最终导致细胞程序性死亡和对病原体的抗性。 效应子的毒力活性与病原体为了确立成功的侵染而对正常宿主细胞功能的操控 或对宿主防御响应的抑制相关。 主要的基因抗性已经被广泛地应用于育种方法中，该抗性依赖于病原体无毒性与 植物抗性基因之间基因对基因的关系。然而，此类抗性通常是小种特异的并且容易被病原 体avr基因的单一突变（为了避开宿主的识别而使选择多样化造成的结果）所克服。因而 此类质量抗性的耐久性令人关注。曾经尝试过在转基因植物中引入新的抗菌/抗真菌基因 或修饰内源性防御相关基因的表达。然而，在许多情况中，该效应是不完全的并且W植物产 量和/或长势为代价。 在本专利技术中，抗性策略专注于那些对亚洲大豆诱病侵染的确立必不可少的病原体 分子的失活。采用了不同的方法来抑制运些关键的大豆诱病分子（称作"效应子"）的活 性。可W进行对隧菌体展示或肤抗体文库的随机高通量筛选，从而识别出结合真菌效应子 并阻断其功能活性的短序列。运些可能是防止效应子与其宿主祀标相互作用的高亲和力肤 序列。 或者，通过此方法识别出的序列可能呈现出与指定吸收进入宿主细胞的效应子部 分紧密结合。在后一种情况中，抑制将来自于对致病因子进入宿主细胞的阻断，而在前一种 情况中，递送进入宿主细胞质的效应子被阻止与宿主祀蛋白发生相互作用和干扰。高亲和 力的、抑制性的肤可能在转基因植物中被过度表达，并且其有效性在ASR病害检测中得到 测试。 在第二种方法中，效应子抑制剂可能基于那些病原体分子的祀标而设计。宿主祀 标可能首先通过酵母双杂交筛选来识别，并随后生成具有改变的效应子结合活性的变体。 尤其值得关注的可能是那些在该植物中无法结合效应子但保留了正常活性的宿主祀标变 体，或是具有显著增强的结合亲和力从而阻止该效应子与其天然祀标相互作用的变体。该 天然祀标和变体可在转基因植物中被过度表达，并且其对诱病侵染的敏感性在与野生型植 物的比较中得到评估。 预期通过此类方法，有可能使若干病原体效应子失活并因而妨碍该病原体侵染大 豆的能力。运一策略可W单独使用或与其他策略相结合从而生产转基因的抗亚洲大豆诱病 的植物。 运些另外的策略包括但绝不限于内源性植物防御分子的修饰表达或来自其它植 物、微生物或动物来源的新分子的异位表达。运些蛋白分子可包括植物免疫受体诸如细胞 内NB-LRR蛋白或细胞外模式识别受体，或抗真菌蛋白诸如植物或微生物防御素。 阳02U层诱菌属（Phakopsora)候选效应子的序列可W作为过度表达或沉默构建体的一 部分被引入植物中。在两种情况中，植物原位（inplanta)表达可W提供关于该病原体蛋白 的功能活性或毒力活性的信息。细菌或卵菌效应子在植物中的过度表达已与可见表型（诸 如叶稱绿病、细胞死亡的诱发、植物生长迟缓等）相关联。植物原位表达可W额外地造成植 物对病原体侵染的易感性的改变。在后一种情况中，如果该病原体效应子的植物原位表达 导致植物防御响应的诱发，可能预期会出现增强的植物抗性。可W预期病原体基因的沉默 构建体将会经该植物RNAi机制加工从而产生小RNA分子，运些小RNA分子被病原体吸收并 与RISC复合体相互作用从而祀向该病原体的mRNAW进行降解。基因沉默和功能丧失的表 型因而可W就病原体基因在决定病原体毒力和感染性中的作用给出重要的线索。另外，关 键毒力基因的下调可能导致削弱的致病性，并因此导致增强的植物抗性。 本专利技术的组合物和方法可用于调节植物中至少一种蛋白的水平。所谓"调节"在 本文中定义为：一种蛋白在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，其包含选自以下的核酸序列：(a)以SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375或377中的任一者示出的核酸序列或其互补序列；以及(b)编码具有以SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376或378中的任一者示出的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：KE博罗格里伊，GJ赖丹，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：美国;US