尿液中核酸的检测制造技术

本发明专利技术提供了用于长度为从51到约110个核苷酸的核酸的稳健、准确且灵敏的检测的方法和组合物，所述核酸可存在于体液例如尿液中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】尿液中核酸的检测相关申请本申请要求来自2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/802，131的优先权的权益，所述美国临时专利申请如同完全阐述一样全文并入本文。公开内容的领域本公开内容涉及用于存在于体液例如尿液中的核酸的稳健、准确且灵敏的检测的方法和组合物。公开内容的背景以前曾报道过血液中片段化的DNA跨越肾屏障(跨肾DNA (TransrenalDNA)或Tr-DNA)并且能够在受试者的尿液中检测到(Botezatu等人，ClinChem.46:1078-1084, 2000 ;Su 等人，J Mol.Diagn.6:101-107，2004 ;和 Su 等人，Ann N YAcad.Sc1.1022:81—89，2004)。已经表明无细胞的跨肾-DNA (Tr-DNA)含有诊断标志物，诸如与大量的基因组DNA不同的特异性的已知序列的情况。例如，对由特征性突变引起的肿瘤-特异性DNA的检测可以用于肿瘤诊断，对孕妇的尿液中的Y染色体-特异性序列的检测可以用于测定胎儿的男性性别，以及对遗传疾病的突变特征的检测可为产前基因检测提供工具(Chan和Lo，SeminCancer B1l.12:489-496，2002 ;Goessl，Expert Rev Mol.Diagn.3:431-442，2003 ；Su 等人，J Mol.Diagn.6:101-107, 2004 ；ffataganara 和 Bianchi，Ann N Y AcadSc1.1022:90-99，2004 ;Botezatu等人，Clin Chem.46:1078-1084，2000 jPDing等人，ProcNatl Acad Sci USA.101:10762-10767，2004)。核酸生物标志物通常本质上是十分特异的，例如在单核苷酸替换、少量核苷酸的插入、少量核苷酸的缺失或重组事件的情况下。另外，生物标志物可以以低浓度存在于体液中，例如在低频事件或妊娠或疾病的早期的情况下。本领域技术人员知晓基于PCR或其他扩增技术的用于检测特定的DNA或RNA序列的灵敏方法。分析了通过常规的基于二氧化硅的方法分离自血浆、尿液和粪便的无细胞DNA,并且发现该无细胞DNA包括约150个碱基对或核苷酸的DNA片段(Chan等人，CancerRes.63:2028-2032, 2003 ;Botezatu等人，Clin Chem.46:1078-1084，2000 ;Su等人，J Mol.Diagn.6:101-107, 2004 ;和 Diehl 等人，Gastroenterology 135:489-98，2008)。然而，应该认识到DNA片段化很可能是随机的，并且因此感兴趣的靶序列可能在已经基本上被随机切割的DNA片段中。在通过随机切割产生的DNA片段群体中，给定的靶序列足够长以用作PCR模板的可能性与靶序列的长度成反比。这在以前已经被阐明(例如在美国专利公开号US 2010/0068711 A的图1中所示出的，在此通过引用以其全部将其并入)。使用较短靶序列中的另一个益处是在无细胞DNA片段中可能存在单链断裂或切口。由于PCR反应需要模板以它们的单链形式，血浆及尿液中的无细胞DNA片段的有效长度比来自双链断裂物的片段化物(fragmentat1n)更短。因此，使用较短的靶尺寸检测片段化的DNA中的特定序列是有优势的。但是当靶尺寸接近于或大于平均片段长度时难以获得该优势。用标准的基于二氧化硅的方法从尿液中制备的DNA含有两种级分。第一种为高分子量DNA，其来源于脱落细胞。第二种为大约150-250个碱基对的低分子量，其为 Tr-DNA 级分(Botezatu 等人，Clin Chem.46:1078-1084，2000 ;和 Su 等人，JMol.Diagn.6:101-107, 2004)。跨肾核酸的分离已经揭示了远少于150个碱基对的DNA及RNA片段在尿液中的存在(参见美国专利申请公开号US 2008/0139801 Al，在此通过引用以其全部将其并入)。本文引用的文献不应被解释为反映承认任一篇是相关的现有技术。此外，它们的引用不指示对相关公开内容的检索。关于文献的日期或内容的所有声明基于可获得的信息并且不是对它们的准确性或正确性的承认。公开内容的概述本公开内容涉及用于分析或检测存在于尿液样品中的核酸序列的方法。核酸序列可被认为是感兴趣的靶序列、或靶核酸或靶核酸序列。由于其穿过血尿屏障(或肾屏障或肾滤过屏障)，核酸序列是在存在于尿液中的一种或更多种核酸分子中存在的核酸序列。因此分子可来自受试者身体的尿道以外的部分。在一些情况下，在分子释放入血流之后在它穿过肾屏障之前，分子可来自肾细胞。因此靶序列存在于跨肾核酸(TR-NA)分子中。在一些情况下，TR-NA是起源于受试者或患者中除了尿道之外的区域的非-宿主核酸。非限制性的实例包括来自移植的组织、在母体受试者或患者的情况下来自胎儿、来自微生物感染以及病毒感染的TR-NA。在其他情况下，TR-NA来自受试者或患者的细胞。非限制性的实例包括癌细胞、感染的细胞以及正在经受凋亡的细胞。由于细胞无法通过肾屏障，预期TR-NA在尿液样品中是无细胞的。由于来自尿道的部分的细胞释放入尿液的可能性，本文公开的方法的许多实施方案中将感兴趣的TR-NA与细胞分离。因此在许多实施方案中，将尿液样品分为含有细胞的级分和含有TR-NA的无细胞级分。在一些情况下，TR-NA在无细胞级分中可与蛋白质或含有蛋白质的复合物结合。在另外的实施方案中，无细胞级分的分离可包括将较小的TR-NA分子与较大的细胞相关的核酸分子分离。在一些情况下，分离可产生包含为150个碱基对或更少、200个碱基对或更少、250个碱基对或更少或300个碱基对或更少的TR-NA的无细胞级分。在一方面，本公开内容涉及用于分析或检测存在于尿液中的一种或更多种跨肾脱氧核糖核酸(DNA)分子中的靶序列的方法。在一些情况下，分析或检测包括使跨肾DNA(TR-DNA)分子与一种或更多种引物接触，以便引物延伸(DNA聚合)的启动以及延伸结果的检测允许分析或检测靶序列，所述一种或更多种引物与TR-DNA的全部或部分互补。在一些情况下，对TR-DNA分级，以包含150个碱基对或更少、200个碱基对或更少、250个碱基对或更少或300个碱基对或更少的片段。在一些实施方案中，使用引物延伸测序TR-DNA。因此公开的方法的分析或检测可包括测序一种或更多种TR-DNA分子。可将技术人员已知的任何测序方法应用到包括测序的公开的方法的实践中。非限制性的实例包括“单分子”测序方法以及基于检测来自DNA聚合反应的反应产物的方法。在一些情况下，测序为约110个核苷酸或更短的长度的测序。在其他实施方案中，使用一对引物，并且使用引物延伸以合成双链DNA(dsDNA)。在一些情况下，使用引物以扩增TR-DNA序列，诸如通过基于聚合酶链式反应(PCR)的方法。因此本公开内容包括一种用于通过在模板DNA分子的存在下延伸正向引物和反向引物从TR-DNA合成多拷贝的dsDNA分子或扩增dsDNA分子的方法。在一些情况下，对TR-DNA分级，以包含150个碱基对或更少、200本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分析靶核酸序列的方法，所述方法包括：(a)获取来自受试者的尿液样品；(b)将所述尿液样品中的跨肾核酸(TR‑NA)与大于300个碱基对的核酸分离；和(c)分析分离的TR‑NA的长度为51到110个核苷酸的一种或更多种靶序列，其中所述分析包括使所述TR‑NA与一种或更多种引物接触，所述一种或更多种引物与所述TR‑NA的至少一部分互补；允许从所述引物启动引物延伸；以及检测所述引物延伸的结果。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：查尔斯·罗迪，塞西尔·罗斯·维巴特，
申请(专利权)人：特罗瓦基因公司，
类型：发明
国别省市：美国;US