本发明专利技术公开了一种酶法制备谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：(1)利用GshF在反应罐中生成谷胱甘肽；(2)在反应罐中加入再生酶，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP；(3)在反应罐中分离固定化的GshF和再生酶，或使用过滤设备分离游离的GshF和再生酶；以及(4)分离产物GSH及反应液中的ATP、ADP和AMP。本发明专利技术的制备方法使用GshF酶代替Gsh I酶和Gsh II酶，使两步反应变为一步反应，节省了时间，也降低了GSH对两步反应的反馈抑制；建立了GSH生产的ATP再生系统，减少了ATP用量，降低了成本；避免了使用酵母再生ATP引入的色素等杂质，易于纯化；建立了酶的回收体系，可大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及制备谷胱甘肽的方法，特别涉及。
技术介绍
谷胱甘肽广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，具有还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，生物体内大量存在并起主要作用的是GSH，广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病，并作为生物活性添加剂及抗氧化剂用于食品领域。GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)经肽键缩合而成的三肽。相对分子质量为307.32，等电点为5.93，常温下为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。目前谷胱甘肽的主要制备方法有:溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。从谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高，而且消耗大量粮食，现已较少使用。化学合成法合成GSH，由于活性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度不高，难以推广。目前国内外GSH生产基本采用发酵法，原理是将编码GSH合成酶系的基因克隆到大肠杆菌或酵母中，使用微生物发酵生产GSH。酵母发酵法，工艺较成熟，但生产周期长，产量偏低，且过多的副产物使下游工艺处理复杂。近年来酶法生产GSH技术逐步提高，使大规模生产变为可能。经典的酶法生产GSH依赖于γ_谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh I)和谷胱甘肽合成酶(Gsh II)两种酶，Gsh I催化L-谷氨酸和L-半胱氨酸合成γ -谷氨酰半胱氨酸，Gsh II催化γ -谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。在GSH合成过程中，由于Gsh I催化过程受到终产物GSH的反馈抑制，因此使生成γ -谷氨酰半胱氨酸的第一步反应成为整个GSH合成的限速步骤。随着进一步研究，人们在单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等十几种细菌中都发现了一种双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)。该酶同时具有Gsh I与Gsh II的活性，可一步催化GSH合成，且该酶反馈抑制作用较小，非常适和应用于酶法合成谷胱甘肽。酶法合成GSH的最大问题是ATP的大量消耗，为了解决这方面的问题，可使用酵母糖酵解再生ATP的方法与之偶联。专利CN201210201691.2中使用该方法再生ATP，效果稳定。但使用酵母会在反应体系中引入色素等杂质，给进一步纯化增加难度，使用酶系再生ATP是近年来的研究方向。研究表明，在某些细菌体内存在着依赖于多聚磷酸盐的酶系，可利用ADP或AMP再生ATP。该酶系包含多聚磷酸盐激酶(Ppk)、腺苷酸激酶(Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(Pap)中的一种或多种，其中，Ppk催化ADP与多聚磷酸盐反应生成ATP, Adk催化2分子ADP生成I分子ATP和I分子AMP，Pap则催化AMP与多聚磷酸盐反应生成ADP，三种酶互相组合或单独使用，均有再生ATP的效果。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，从而克服现有技术的上述缺陷。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:，包括以下步骤:(I)利用GshF在反应罐中生成谷胱甘肽；(2)在反应罐中加入再生酶，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP ；(3)在反应罐中分离固定化的GshF和再生酶，或使用过滤设备分离游离的GshF和再生酶；以及(4)分离产物GSH及反应液中的ATP、ADP和AMP。优选地，上述方法进一步包括以下步骤:(5)步骤(3)中分离的GshF和再生酶的循环利用，即将分离的GshF和再生酶添加至反应罐中生成谷胱甘肽及再生ATP的连续反应；以及(6) GshF和再生酶的连续分离，即连续分离固定化的GshF酶和再生酶或使用过滤设备连续分离游离的GshF和再生酶。优选地，上述方法进一步包括以下步骤:(7)产物GSH的连续分离。(8) ATP、ADP 和 AMP 的连续分离。优选地，上述技术方案中，循环利用GshF酶和再生酶，即重复所述步骤(4)至所述步骤(8)至少一次或重复多次。优选地，上述技术方案中，步骤(7)和步骤⑶反应生成的GSH及ATP、ADP和AMP通过直接取出，或通过过滤或离子交换方法分离。优选地，上述技术方案中，上述再生酶为Ppk、Adk或Pap酶的一种或任意几种组入口 ο优选地，上述技术方案中，上述步骤(I)中在反应罐中生成谷胱甘肽的反应如下:反应温度为25-55 °C ；反应pH为5-10的条件下；反应体系为含有底物谷氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、镁离子、钾离子、钠离子、Tris或磷酸盐的水溶液；在反应体系中添加ATP和GshF酶，或添加再生的ATP和分离的GshF酶，反应生成谷胱甘肽；再添加Ppk、Adk或Pap酶的一种或几种，同时添加多聚磷酸或其盐，反应生成谷胱甘肽的同时再生ATP。优选地，上述技术方案中，镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁或硝酸镁中的一种或多种；所述钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾或柠檬酸钾中的一种或多种；所述钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种；所述多聚磷酸盐选自于多聚磷酸钠或多聚磷酸钾中的一种或多种。本专利技术方法中循环利用的GshF和再生酶为游离或者固定化的GshF和再生酶。本专利技术方法中所提及的氨基酸或其盐均为L型氨基酸或其盐。更具体地，本专利技术方法包括以下步骤:(I)生成谷胱甘肽:在反应体系中添加ATP和GshF酶，在25-55°C、pH为5-10的条件下反应生成GSH，其中所述反应体系为含有底物谷氨酸或其盐、半胱氨酸或其盐和甘氨酸或其盐、以及镁离子、钾离子、钠离子和Tris或磷酸根离子的水溶液；(2) ATP 再生:加入再生酶系，加入多聚磷酸或其盐，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP。其中所述再生酶系为Ppk、Adk和Pap酶的一种或多种组合，即单独使用Ppk或Adk或Pap，或使用Ppk和Adk组合或Adk和Pap组合或Ppk和Pap组合或Ppk和Adk和Pap组合；(3)分离GshF和再生酶:固定化的GshF和再生酶在反应罐中直接分离。固定方法为戊二醛交联、海藻酸钠包埋等本领域技术人员熟知的固定方法。游离的GshF和再生酶通过滤器中超滤膜分离，其中所述过滤器具有进料口、出料口和回流口，内设截留分子量小于50kDa的膜。经过滤器的滤出液为分离出酶之后的反应液；以及 (4)分离产物 GSH 及 ATP、ADP 和 AMP通过本领域技术人员熟知的离子交换方法，从所述步骤(3)的滤出液中分离产物GSH,经离子交换后的穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP。本专利技术的方法中所述步骤(I)至所述步骤(4)可以重复至少一次，优选重复多次，例如重复 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50 次等。本专利技术所采用的GshF、Ppk、Adk和Pap酶来源于任何生物，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。本专利技术方法步骤⑴添加的ATP为l_50g/L ;添加的GshF酶的浓度为0.01_5g/L ；所述步骤(I)或步骤(I)的连续反应步骤中，反应温度为25-55°C，优选30-50°C ;反应pH为5-10，优选6-9 ;反应体系为含有底物l_12g/L谷氨酸或本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶法制备谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用GshF在反应罐中生成谷胱甘肽；(2)在反应罐中加入再生酶，将反应生成的ADP和/或AMP再生为ATP；(3)在反应罐中分离固定化的GshF和再生酶，或使用过滤设备分离游离的GshF和再生酶；以及(4)分离产物GSH及反应液中的ATP、ADP和AMP。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘珊珊，秦永发，
申请(专利权)人：深圳市古特新生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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