一种利用代谢基因工程提高硅藻油脂含量的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用代谢基因工程提高硅藻油脂含量的方法。克隆海洋产油硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)甘油-3-磷酸酰基转移酶基因cDNA，经在酵母甘油-3-磷酸酰基转移酶基因突变体中验证功能，构建硅藻过表达载体，利用电激法或基因枪法导入三角褐指藻细胞，经草丁膦筛选获得甘油三酯(TAG)含量提高的工程藻株，可经放大培养用于提取微藻油脂。本发明专利技术将硅藻中的甘油-3-磷酸酰基转移酶作为硅藻油脂代谢基因工程调控的靶点，采用代谢工程的方法提高了硅藻油脂含量，为硅藻油脂研究提供了新的思路和着眼点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，设及一种利用代谢基因工程技术、通过导入内源甘 油-3-憐酸酷基转移酶基因提高娃藻油脂含量的方法。
技术介绍
生物柴油度iodiesel)是指来自生物体的油脂（主要为甘油S醋）与醇类（甲醇 或乙醇）经醋交换作用而形成单烷基脂肪酸醋。生物柴油的性能跟石化柴油基本相当，具 有良好环保性和生物降解性，已成为国际上应用最广、发展最快的理想可再生能源。 单细胞真核微藻是光合自养型的低等水生植物，种类繁多，分布广泛，具有光合作 用效率高，生长快速，生物量大等特点。部分来自绿藻口和娃藻口的微藻种类油脂含量较为 可观，已成为制备生物柴油的优质天然原料，与木本油料植物（油桐、麻疯树、黄连木等）相 比，海洋微藻养殖不占用耕地、不消耗淡水，是未来生物柴油发展的研究热点。目前，微藻生物柴油的生产能耗和高昂成本是阻碍其产业化的关键问题。改进微 藻培养技术、优化产油条件W及微藻产物分离方法，特别是提高微藻自身的产油能力，是降 低制备成本、提高生物柴油的产量和质量的重要途径，其中，经筛选、诱变或基因工程定向 育种获得含油量高的优质藻种极为关键。 微藻与高等植物的脂类合成途径基本相同。质体中脂肪酸合成的前体物为乙 酷-CoA,两个乙酷-CoA在乙酷-CoA簇化酶的催化作用下合成丙二酷-CoA。然后，W丙二 酷-CoA为底物，在脂肪酸合成酶系（FA巧催化下进行连续的聚合反应，每次循环都W增加 两个碳的方式合成酷基碳链，最终在硫醋酶的催化下生成16至18碳的饱和脂肪酸。游离 脂肪酸通过质体膜的转运进入胞质中，大都W酷基CoA形式存在，经=种不同酷基转移酶 的催化最终合成甘油=醋，运=种酶均位于内质网膜上，可定义为甘油=醋组装酶，分别是 甘油-3-憐酸酷基转移酶、溶血憐脂酸酷基转移酶和二酷甘油酷基转移酶，它们分别作用 于甘油骨架的Sn-1、Sn-2和Sn-3位。 植物脂类合成途径的解析为油脂代谢基因工程提供了遗传操作的祀点。其中，最 初步骤的乙酷-CoA簇化酶和最终步骤的二酷甘油酷基转移酶是最常见的祀点，采用策略 是通过基因工程，实现同源或异源上述基因的过表达，最终增加甘油=醋的含量。 乙酷-CoA簇化酶是脂肪酸从头生物合成的关键限速酶，可调控碳流进入脂肪酸 生物合成途径。油菜和±豆中的研究表明，基因导入可有效提高甘油=醋含量，但在海洋娃 藻中未获成功。二酷甘油酷基转移酶的底物二酷甘油有两条去路：合成憐脂或者甘油=醋， 因此，二酷甘油酷基转移酶也是合成甘油=醋的关键酶和限速酶。高等植物与微藻油脂代 谢基因工程研究表明，向细胞中导入二酷甘油酷基转移酶基因并使之过表达，可W导致二 酷甘油更多合成甘油=醋。 由于进化上娃藻与高等植物相比具有明显差异，极有可能存在特殊的油脂合成积 累调控机制，例如，近期研究发现，娃藻中来自细胞糖酵解与支链氨基酸降解的碳流导致了 娃藻细胞的油脂积累，运与高等植物明显不同。因此，很有必要针对娃藻油脂代谢途径中的 酶编码基因，寻找适合娃藻油脂代谢基因工程操作的全新祀点。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种利用代谢基因工程技术、通过导入内源 甘油-3-憐酸酷基转移酶基因提高娃藻油脂含量的方法。 为实现上述目的，本专利技术技术方案如下：一种利用代谢基因工程技术提高娃藻油 脂含量的方法，将娃藻中的甘油-3-憐酸酷基转移酶作为娃藻油脂代谢基因工程调控的祀 点，克隆娃藻甘油-3-憐酸酷基转移酶基因，构建表达载体，再导入娃藻细胞，经筛选和检 验获得油脂含量提升的转化藻株。 所述方法具体步骤为： 1)克隆娃藻甘油-3-憐酸酷基转移酶基因，利用CDNA序列构建酵母表达载体； 2)利用酵母甘油-3-憐酸酷基转移酶突变体的回复突变验证该基因功能； 3)构建娃藻表达载体，导入娃藻细胞，经筛选和检验获得油脂含量提升的转化藻 株。所述娃藻为S角褐指藻（Phaeodact}dum tricornutum)、小环藻（切clotella SP.)等产油海洋娃藻。 所述娃藻表达载体包含娃藻内源启动子、终止子等基因表达调控元件，W及除草 剂草下麟抗性基因。所述筛选为将转化细胞涂布含有一定剂量除草剂草下麟的平板，培养抗性转化 子。与现有方法相比，本专利技术提出了一种新思路，具有如下有益效果： 1.本专利技术首次发现，娃藻中的甘油-3-憐酸酷基转移酶，即针对游离脂肪酸与甘 油结合的第一步酶促反应的作用酶，对于娃藻甘油=醋的最终积累合成非常重要，可W作 为娃藻油脂代谢基因工程调控的潜在新祀点。 2.本专利技术首次将娃藻甘油-3-憐酸酷基转移酶基因导入娃藻，经筛选可成功获得 转化子，检测发现可W实现导入基因的整合，其过表达可W提高娃藻的油脂含量，证明是一 条实践可行的娃藻油脂代谢基因工程调控的新途径。 本专利技术通过导入娃藻来源的油脂代谢关键基因一-甘油-3-憐酸酷基转移酶基 因，使其过表达，从而促进游离脂肪酸与甘油的结合，最终获得甘油=醋含量提升的工程娃 藻藻株，通过对工程藻株进行放大培养来提取油脂，从而采用代谢工程的方法提高了娃藻 油脂含量，为娃藻油脂研究提供了新的思路和着眼点。【附图说明】 图1为S角褐指藻甘油-3-憐酸酷基转移酶基因CDNA序列的克隆（M=Marker;0 : 空白对照）。 图2为酵母表达出发载体PYES2。 图3为酵母表达载体pYGPAT1。[002引 图4为酵母Y13037阳性克隆的PCR鉴定结果。其中，1-4为Y13037菌株中导入 PYES2质粒的阳性菌株中提取的质粒样品；5-8为Y13037菌株中导入pYGPATl质粒的阳性 菌株中提取的质粒样品。 图5为酵母Y15983阳性克隆的PCR鉴定结果。其中，1-8为Y15983菌株中导入 pYGPAT1质粒的阳性菌株中提取的质粒样品；9-14为Yl3037菌株中导入PYES2质粒的阳性 菌株中提取的质粒样品。 图6为酵母pYGPATl转化子尼罗红染色巧光观察。（左：野生型酵母导入空载 PYES2;右：野生型酵母导入pYGPATl)。 图7为酵母pYGPATl转化子液相色谱TAG定量分析（SY:野生型酵母导入空载 PYES2;SG:野生型酵母导入pGPATl;Y1-Y:缺陷型突变株Y13037导入空载PYES2 ;Y1-G:缺 陷型突变株Y13037导入pGPATl;Y2-Y:缺陷型突变株Y15983导入空载PYES2 ;Y2-G:缺陷 型突变株Y15983导入pGPATl)。 图8为娃藻核表达骨架载体pfcpA-MCS-fc地-bar。 图9为S角褐指藻甘油-3-憐酸酷基转移酶基因过表达载体 pfcpA-gpat1-fcpB-bar〇 图10为S角褐指藻甘油-3-憐酸酷基转移酶基因过表达载体 PfcpA-甜atl-fc地-bar的PCR检测结果，条带示扩增出的预期大小的片段。图11为电激法转化=角褐指藻经草下麟筛选获得的抗性藻落（左上：未经转化的 空白对照；右上：转化过表达载体pfcpA-甜atl-fc地-bar)图12为挑取草下麟抗性单藻落转入24孔板进行扩培的结果。 图13为S角褐指藻转化子PCR检测结果。 图14为S角褐指藻转化子液相色谱TAG定量分析化lank:野生型出发藻株； transformant:导入pfcpA-甜atl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用代谢基因工程技术提高硅藻油脂含量的方法，其特征在于，将硅藻中的甘油‑3‑磷酸酰基转移酶作为硅藻油脂代谢基因工程调控的靶点，克隆硅藻甘油‑3‑磷酸酰基转移酶基因，构建表达载体，再导入硅藻细胞，经筛选和检验获得油脂含量提升的转化藻株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜鹏，郭扬，赵瑾，陈华新，
申请(专利权)人：南通中国科学院海洋研究所海洋科学与技术研究发展中心，中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32