本发明专利技术公开了一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用。检测试剂盒包括引物、内参基因和阴性对照；所述引物的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.42～82所示中的至少一种，反向引物的碱基序列如SEQ ID No.83所示。本发明专利技术发现SEQ ID No.1～41所示的miRNA分子在肺癌组织、癌旁组织以及正常组织中均存在差异性表达，且差异性表达显著，可用作肺癌诊断标记物，并针对miRNA分子设计了相应的引物以及含有该引物的试剂盒，通过对样品进行实时荧光定量PCR，检测该样品中是否存在差异性表达miRNA，即可对该样品所属个体是否患有肺癌进行初步判断，为临床诊断和预后提供参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药生物领域，具体涉及一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂 盒及其应用。
技术介绍
肺癌已成为世界范围内最主要的肿瘤死亡原因，大约31%与癌症相关的死亡是由 肺癌造成的。早期诊断是降低癌症患者死亡率的关键因素。目前的临床诊断手段对发现早 期肺癌并不十分有效，3/4的病人在确诊时肺癌已发生转移。另外，由于肺癌的多样性和复 杂性，许多肺癌患者的发展和治疗结果与临床分期极不相符，导致同期的癌症患者在接受 相同的治疗措施后，预后效果却差异很大。因此寻找早期肺癌诊断W及分子分型的临床分 子标记物成为当务之急，是急需解决的重大科学问题。 现有的临床诊断技术远不能满足早期诊断的需要。早期的X光仅能发现直径在 IcmW上的瘤块，CT扫描及B超检查，可检出直径在0. 5cm左右的肿瘤，MRI和阳T检查，可 W发现更小的肿瘤组织，但其特异性低，仍需要病理活检的辅助才能明确诊断。支气管镜、 胃镜、膀脫镜等内窥镜的使用，极大地提高了肺癌、消化系统肿瘤及膀脫癌等的诊断率，但 均为介入性检查，对患者的损伤和痛苦大，且对操作者技术要求高，价格昂贵，不适用于大 规模的人群筛选普查。因此，寻找正确、可靠的、无创伤的肿瘤早期诊断方法成为当务之急。 早期诊断肿瘤最快速的方法是通过检测和分析血液中的肿瘤标记物。送些分子标记物并不 局限于原发肿瘤所处的位置，而且较易采集，在肿瘤的早期诊断和预后等方面发挥着重要 作用。目前，人类发现的血清标记物已有百余种，但由于肿瘤的多样性和复杂性，特异性 强、具有明确诊断作用的标记物并不多。临床常用的仅20多种，能用于大规模人群普查的 肿瘤标记物更少。美国食品医药管理局（抑A)批准的生物指标如甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原 (CEA)和前列腺特异抗原（PSA)等，对肝癌、结肠癌及前列腺癌诊断的特异性和敏感性都较 低，无法达到诊断肿瘤的指标，只能作为诊断的辅助指标或者与其他临床参数一起作为判 断患者预后的参考指标。 研究发现，循环miRNA不仅能有效区分正常个体和肿瘤病人，而且能正确评估肿 瘤的恶性程度。血浆miR-92用于结直肠癌的分子诊断，其灵敏度可达89%，特异度达到 70%，肿瘤切除后血浆miR-92的表达水平较术前显著降低。血清miR-21的浓度不仅能区 分乳腺癌病人和健康个体，而且能区分乳腺癌早期和晚期病例。 近几年来，随着对miRNA研究的深入，人们发现循环miRNA不仅具有良好的稳定 性，而且具有显著的肿瘤相关性和组织特异性，送些研究奠定了循环miRNA作为肿瘤生物 标记物的理论基础。细胞中miRNA能在转录后水平调控祀基因表达和蛋白质翻译，广泛参 与各种正常的生命过程，其功能失调与肿瘤的发生、发展密切相关。然而多数循环miRNA的 生成机制、生物学功能W及与相关肿瘤的关系目前尚不明确。
技术实现思路
本专利技术提供了一类用作肺癌诊断标记物的miRNA，该miRNA在肺癌组织中存在差 异表达。 本专利技术利用miRNA基因芯片灯aqManMicroRNAArrayQuimanA+B板3.0)技术对 临床收集的正常肺组织和肺癌组织标本进行分析，筛选出在肺癌组织中表达均异常且有明 显上升趋势的118种miRNA分子。然后利用实时英光定量PCR对筛选得到的118种miRNA 分子进行验证和进一步筛选，从中得到了 41种miRNA分子。 申请人发现，送41种miRNA分子在肺癌组织、癌旁组织W及正常组织中均存在差 异性表达，且差异性表达显著，因此可作为肺癌诊断标记物，用于判断受检个体是否有肺癌 风险。 因此，本专利技术提供了miRNA作为标记物在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的应用， 所述miRNA为碱基序列如SEQIDNo. 1~41所示核巧酸中的一种或多种。 利用该试剂盒进行肺癌诊断时，如所述试剂盒检测出样品中所述miRNA的表达量 与阴性对照相比具有显著差异，则诊断为有患癌风险。所述样品优选为血清。 作为优选，所述试剂盒为逆转录实时英光定量PCR试剂盒。利用该试剂盒进行肺 癌诊断的方法，可按W下步骤进行：[001引 （1)提取样品中的miRNA，并将miRNA反转录为CDNA; 似WCDNA为模板，利用引物进行实时英光定量PCR，检测相应miRNA的相对表达 量并与阴性对照进行比较，判断该miRNA是否存在差异性表达。 作为优选，采用2AAET法比较样品与阴性对照中miRNA的相对表达量；然后通过T 检验比较两者的相对表达量是否存在显著差异（P<〇. 05)。若碱基序列如SEQIDNo. 1~41 所示的miRNA分子中的任一种存在差异性表达，则将该样品所属个体诊断为有患癌风险。 本专利技术还提供了一种用于检测肺癌差异性表达microRNA的引物，可用于扩增所 述miRNA分子，其中，正向引物为碱基序列如SEQIDNo. 42~82所示核巧酸中的至少一种， 反向引物为碱基序列如SEQIDNo. 83所示的核巧酸。 碱基序列如SEQIDNo. 42~82所不的正向引物是与碱基序列如SEQIDNo. 1~ 41所示的miRNA分子一一对应的特异性扩增引物，碱基序列如SEQIDNo. 83所示的反向引 物是通用引物。 鉴于所述引物能够特异性扩增上述的miRNA分子，因此本专利技术还提供了所述引物 在制备用于检测肺癌差异性表达microRNA的试剂盒中的应用。 进一步地，本专利技术还提供了一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒，包括所 述引物，W及内参基因和阴性对照。 本专利技术中，所述内参基因为hsa-miR-16-5p。其碱基序列如SEQIDNo. 84所示。 用于扩增该内参基因的引物，其正向引物的碱基序列如SEQIDNo. 85所示，反向引物的碱 基序列如SEQIDNo. 83所示。 阴性对照即为从正常个体组织中提取的miRNA。 进一步地，本专利技术还提供了所述的检测试剂盒在诊断肺癌中的应用；如所述试剂 盒检测出样品中所述miRNA的表达量与阴性对照相比具有显著差异，则诊断为有患癌风 险。 进一步地，本专利技术还提供了所述的检测试剂盒在判断肺癌预后中的应用；如所述 试剂盒检测出样品中所述miRNA的表达量与阴性对照相比具有显著差异，则判断为预后不 良；反之则判断为预后良好。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术发现了碱基序列如SEQIDNo. 1~41所示的miRNA分子在肺癌组织、癌旁 组织W及正常组织中均存在差异性表达，且差异性表达显著，可用作肺癌诊断标记物，并针 对miRNA分子设计了相应的PCR引物，通过对样品进行实时英光定量PCR，检测该样品中是 否存在本专利技术所述的差异性表达miRNA,即可对该样品所属个体是否患有肺癌进行初步判 断，为临床诊断和预后提供参考。【附图说明】 图1为本专利技术差异性表达miRNA的筛选流程图。【具体实施方式】 1基因芯片筛选差异性表达miRNA分子 临床收集15份人正常肺组织（正常组）和15份人肺癌组织（肿瘤组），利用基因 芯片技术分析各样本中的miRNA表达谱。 (1)基因芯片筛选肺癌组织中差异性表达的miRNA 1)总RNA提取 ①称取约50ng组织，在液氮中研磨。 ②将研磨好的组织粉末加入含300U L裂解液的EP管中，充分混匀后本文档来自技高网...
【技术保护点】
miRNA作为标记物在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA为碱基序列如SEQ ID No.1～41所示核苷酸中的一种或多种。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王闻哲，王孝举，马胜林，李伟莉，费正华，丁明建，孟文，张仕蓉，
申请(专利权)人：浙江省医学科学院，杭州市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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