本发明专利技术公开了一种基于三色荧光标记的核酸测序方法。该方法将四类测序探针或核苷酸中三类用不同荧光染料标记、而另一类未做标记。每个DNA模板每次的测序信息通过比较三类标记染料的荧光强度、以及DNA模板定位的杂交荧光强度而获得。当三类荧光强度的数值有明显不同,且其中一类荧光强度数值分别高于另外两类荧光强度数值的3倍以上时,这个高的荧光即为测序信息;而当三类的荧光强度数值相差不大、且其强度低于DNA模板定位的杂交荧光强度的1/3时,未标记的探针或核苷酸即为测序信息。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
,是一种基于=色巧光标记探针或核巧酸实现核酸序列 高通量连接测序方法。
技术介绍
DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学 的发展。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本 的时代。高通量测序技术是对传统测序技术的一次革命性提高,一次能同时对几百万甚至 几千万条DNA序列进行测序。目前主流的高通量测序技术主要有S个代表=Roche公司的 454测序技术、Illumina公司的Solexa测序技术W及ABI公司的SOLiD测序技术。在现有 的测序技术中,通过采用标记探针的连接测序方法或者标记核巧酸的合成测序方法均采用 四色标记的原料实施测序反应。具体而言,合成测序技术采用边合成边测序的方法,在合成 反应中,加入改造过的DNA聚合酶和带有4种巧光标记的dNTP,采集4色巧光之后,将3'端 阻遏基团切除,还原为径基,随后进行第二次循环,重复第一个循环的步骤,直到模板序列 全部被合成双链DNA;而连接技术采用DNA连接酶和带有4种巧光标记的寡核巧酸探针序 列,采集4色巧光之后,将标记基团切除、并衍生出随后进行第二次循环需要的基团,重复 第一个循环的步骤,直到模板序列全部被合成双链DNA。很明显,运种让每个核巧酸(或者 探针)携带一个巧光标记,每一种标记的巧光颜色均不同于其它的核巧酸(或者探针)类 型,其好处是可W通过比较四色巧光的扫描强度,直接读取四色巧光强度中最大者为测序 信息。然而,运种四色巧光标记测序的方法存在下列不足:1)需要四色不同的染料用于标 记,且运四种不同染料的发射波长尽可能不重迭,否则会相互之间发生干扰,运在现实的测 序方法中的确存在;且每增加一种标记染料,标记费用也同时增加。2)每种染料需要单独 的采集,每增加一种染料需要增加相应的光学器件,即增加测序仪器的制造成本;同时,每 增加一种染料就需要花费采集该染料的扫描时间,因而,增加测序时间;而巧光强度的采集 占用了测序总时间的二分之一,且四种不同染料所花费的时间也不相同。在连接法测序中, 采集异硫氯酸巧光素(FITC)的时间大约为采集德克萨斯红灯exasRed)、花青素5 (切5)、 花青素3(切3)=种染料的时间总和。因此,如果采用=色巧光、而不是现有的四色巧光标 记方法实施高通量DNA测序,不仅测序仪器的复杂程度可W降低;同时,测序费用和操作时 间也会大大降低,其效率将提高20%W上。然而,一个很明显的问题是,如何获取没进行标 记探针的测序信息?根据现有测序方法,在进行序列测定前,首先会采用杂交标记序列的 方法将所有忍片上的DNA模板进行位置确定。因此,每个DNA模板将有一个杂交的初始巧 光强度数值。而当采用S色巧光标记进行测序反应时,每个不同位置上的DNA模板均可W 获得=个不同的巧光强度数值。运=个数值包括两种情况:一种情况是包含"正确"的测序 巧光,那么在运种情况下,"正确"的测序巧光强度数值就要明显大于另外两个"错误"的数 值;第二种情况是不包含"正确"的测序巧光,那么运立种"错误"的巧光强度数值,相对于 该DNA模板杂交的初始巧光强度就会少很多。从上述分析可W看出,S色巧光标记的测序 方法同样可W获取准确的测序信息。
技术实现思路
专利技术目的:针对现有四色巧光标记测序技术存在的问题,本专利技术提出了一种基于 =色巧光标记的核酸测序方法。 技术方案:为实现上述技术目的,本专利技术提出一种基于=色巧光标记的核酸测序 方法,使用四类核巧酸或探针进行测序,其中,=类核巧酸或探针是用不同巧光染料标记、 而另一类是未做标记的,每个DNA模板每次的测序信息通过比较S类标记染料的巧光强 度、W及DNA模板定位的杂交巧光强度而获得。 阳0化]具体地,当使用核巧酸测序时,所述核巧酸为修饰的四种dNTPs,用于合成测序方 法;当使用探针测序时,所述探针为修饰或者未修饰的寡核巧酸序列,用于连接测序方法; 所述探针按照单碱基标记模式包括四种探针,其中,每种探针对应一个明确的碱基,两碱基 标记模式包含四类共十六种探针,每种探针对应两个明确的碱基。 其中,所述DNA模板定位是指用巧光标记的寡核巧酸序列与高通量DNA测序反应 池忍片上所有扩增DNA模板进行杂交、扫描,而当扫描获得的巧光强度明显高于背景数值 时,确定该DNA模板为有效测序模板,并记录该DNA的巧光强度W及位置坐标信息。 所述测序信息通过比较单个测序反应的S类标记染料巧光强度、W及DNA模板定 位的杂交巧光强度而获得,具体方式为: (1)当S类巧光强度的数值有明显不同,即其中一类巧光强度数值分别高于另外 两类巧光强度数值的3倍W上时,运个高的巧光强度值即为测序信息; (2)当S类巧光强度数值相差不大、且其强度低于DNA模板定位的杂交巧光强度 值的1/3时,未标记的探针或核巧酸即为测序信息。 有益效果:本专利技术与现有技术相比,具有如下优点: (1)本专利技术大大降低测序试剂费用和操作时间,由于只标记=种、而不是四种探针 原料,其探针原料费用将降低20% ;由于扫描只针对=种染料而不是四种进行成像,扫描操 作时间至少减少25% ; (2)本专利技术与现有使用巧光染料标记原料的连接测序、合成测序平台兼容、且可W 根据使用的染料对仪器进行简化,降低测序仪的成本。【具体实施方式】 下面通过具体的实施例详细说明本专利技术。 实施例1 色标记巧光探针连接测序法测定人全基因组。 本实施例给出了利用一种=色标记巧光探针连接测序法测定人全基因组的方法。 具体如下: 1、按照文献(PuD,etal.JournalofBiomedicalNanotechnology, 2014,10 巧), 751-759)合成含有3'硫代-次黄嚷岭脱氧核巧的寡核巧酸测序探针=色巧光标记(见表 1,序列中X即为3'硫代-次黄嚷岭脱氧核巧,I为次黄嚷岭脱氧核巧狂和I均为通用碱 基,与A、G、C、T均能形成互补),N为混合核巧(即碱基A、G、C、T各含有25 %的含量),德 克萨斯红(TexasRed)、花青素5 (切5)、花青素3 (切3)为=种不同染料,分别标识探针距离 3端第5个碱基位置的碱基G、C、T)。下述四类探针均是混合物,目的是满足高通量DM测 序所有可能的DNA模板,此时,每类探针包含44个具体的探针,即每个NN順均有44种类型。 表1循环连接测序探针 2、按照文献GhendureJ,etal.Science, 2005, 309 巧741) :1728-1732)制备人的 全基因组测序模板。将人基因组用酶切割(或者超声破碎)成大小为50~1000碱基的片 段,并在连接酶的作用下将运些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接(假定均为20 个碱基),其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补,而另一个连接 子的寡核酸序列包含了所有测序引物的序列信息。将运些连接臂连接的片段化核酸序列与 固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行PCR反应,扩增片段化的人全基因组。并将运些 微珠固定到平板基片上,通过酶切或者变性得到人全基因组测序模板。 3、将测序定位引物与人全基因组测序模板杂交,并在清除未杂交引物后,进行扫 描分析,确定每个D本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于三色荧光标记的核酸测序方法,其特征在于,使用四类核苷酸或探针进行测序,其中,三类核苷酸或探针是用不同荧光染料标记、而另一类是未做标记的,每个DNA模板每次的测序信息通过比较三类标记染料的荧光强度、以及DNA模板定位的杂交荧光强度而获得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:肖鹏峰,王柳,
申请(专利权)人:东南大学,
类型:发明
国别省市:江苏;32
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