血清SHBG蛋白作为肺结核病血清标志物及其应用制造技术

一种血清SHBG(Sex hormone‑binding globulin)蛋白作为肺结核病人血清标志物及其应用，所述血清SHBG蛋白在涂阴、涂阳肺结核和耐多药肺结核病人血清中表达水平明显增高，可利用iTRAQ结合MALDI‑TOF/MS技术检测，质谱检测SHBG蛋白5条肽段在涂阴、涂阳肺结核和耐多药肺结核病人血清中表达水平明显高于肺炎病人和正常人的血清中表达水平，ELISA和免疫组织化学也验证SHBG蛋白在肺结核病人血清和组织中高表达。适用于肺结核病血清的辅助检测，发病机制研究和抗结核病药物开发。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种血清标志物的应用，具体为一种血清SHBG蛋白作为肺结核病人血清标志物及其应用。
技术介绍
结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，潜伏期4?8周，其中80%发生在肺部。我国属于全球22个结核病高负担国家之一，患病人数仅次于印度，位居世界第二位，除了患病人数多，我国结核病耐药的严重程度在全球范围内仅次于俄罗斯，耐药性泛滥将会使结核病控制返回到无化疗时代，而当今世界约有三分之二的结核病人处于发生耐多药的危险之中。因此，结核病和耐药结核病已成为我国严重的公共卫生和社会问题。由于目前临床常规的痰涂片和痰培养检测结核杆菌的方法，存在检出率低和/或培养时间长等问题，远不能满足临床检测的需求；同时目前临床的抗结核病药物治疗存在耐药，肝功损害、胃肠道不适、过敏等副作用，以及抗痨药物修复病灶能力差，后遗症等问题，因此，开发新的疾病标志物，对结核病的防治具有重要意义。近年来，随着质谱技术的飞速发展和蛋白质组学研究的深入，产生了血清定量蛋白组学新技术，该技术旨在应用质谱技术筛选和鉴定不同疾病循环血清中的标志物，利用该技术已经发现和确定了许多新的疾病标志物，为进一步揭示疾病的致病机制，引导新的药物靶标的发现提供了重要的线索，本专利技术就是血清定量蛋白组学技术在结核病研究中的新发现。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种血清SHBG蛋白作为肺结核病人血清标志物及其应用，解决现有技术存在的检出率低和/或培养时间长的问题，同时解决目前临床的抗结核病药物治疗存在耐药，肝功损害、胃肠道不适、过敏等副作用，以及抗痨药物修复病灶能力差，后遗症的问题。适用于肺结核病血清辅助检测，发病机制研究和抗结核病药物开发。本专利技术的技术方案是:一种血清SHBG(Sex hormone-binding globulin)蛋白作为肺结核病人血清标志物，是利用iTRAQ (isobaric tags for relative and absolutequantitat1n, iTRAQ)结合MALD1-TOF/MS技术检测涂阴肺结核病病人、涂阳肺结核病人、耐药肺结核病人、肺炎病人和正常人的血清，SHBG蛋白在涂阴、涂阳肺结核和耐多药肺结核病人血清中表达水平明显高于肺炎病人和正常人的血清中表达水平，ELISA和免疫组织化学也验证SHBG蛋白在肺结核病人血清和组织中高表达。所述SHBG蛋白在肺结核病人血清和组织中高表达是指以下5个肽段表达水平增高:IALGGLLFPASNLR，QAEISASAPTSLR，LPLVPALDGCLR，SCDVESNPGIFLPPGTQAEFNLR，WHQVEVK。本专利技术的显著效果在于:采用基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学对结核病的全面系统的研究，得到一种血清SHBG蛋白作为结核病人血清标志物，该标志物经过大样本的血清ELISA和免疫组织化学的验证，结果更为可靠，可为临床应用提供有价值的信息。【附图说明】图1.SHBG的iTRAQ的相对定量分析图SCDVESNPGIFLPPGTQAEFNLR肽段的iTRAQ的相对定量分析图，与正常人和肺炎比，该肽段在肺结核病血清中明显高表达。图2.ELISA检测SHBG的表达水平图Healthy control:正常对照，Pneumonia:肺炎，SNP-TB:涂阴肺结核病，DR-TB:耐药肺结核病，SPP-TB:涂阳肺结核病，ELISA检测血清SHBG的表达水平，与正常对照和肺炎相比，SHBG蛋白的表达水平在涂阴肺结核病病人，耐药肺结核病人、涂阳肺结核病人血清中明显高表达。图3.免疫组织化学实验检测SHBG蛋白的表达水平免疫组织化学检测SHBG蛋白在肺结核组织和对照组织中的表达水平。与对照组比，SHBG蛋白在肺结核病组织中明显高表达。【具体实施方式】以下通过具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步描述。实施例1血清定量蛋白组技术检测SHBG蛋白五个肽段在结核病人血清中表达增高1.检测样本:耐多药结核病、涂阴结核病、涂阳结核病、肺炎病人和正常对照血清各10例。清晨空腹采集2mL全血，4°C静置l_2h待血液凝固析出血清，3000g离心lOmin，收集上清液，冰上分装后存至-80°C备用。2.检测方法:(I)去除高丰度蛋白:按照多重亲和去除系统humanl4色谱柱操作说明，去除血清高丰度蛋白，将收集到的馏分用冻干机浓缩。(2)脱盐和蛋白含量检测:除高丰度蛋白后的血清用3000MWC0超滤离心管，加入50mmol/L pH 8.5三乙胺碳酸氢缓冲液，反复3次，脱盐和收集蛋白片段；采用BCA法测定血清蛋白含量，每组低丰度蛋白取100 μ g/管，冻干。(3)蛋白酶解和标记iTRAQ:将干燥样品加入胰蛋白酶，37°C消化过夜；酶解样品真空干燥后，溶于iTRAQ溶液缓冲液中；iTRAQ试剂113、117、118、119、120分别标记健康对照组、耐多药组、涂阳组、涂阴组和肺炎组血清蛋白多肽，标记后的样品经过C18spin column除盐柱除盐，冻干。(4)离线二维液相色谱分离与点革E:干燥的标记样品用上样缓冲液A(10mmOl/L KH2P04, 25% CAN, pH 2.7)复溶并稀释10倍，上样到SCX预装柱，经上样缓冲液A洗涤后，用含有KCl浓度分别为35、50、75、100、125、150、175、200、250和300mmol/L的缓冲液B分布洗脱，收集不同梯度浓度条件下洗脱的多肽。收集到的各组份样品稀释后进行反相C18柱梯度淋洗和点靶。(5)质谱分析与数据处理:标记肽段的串联质谱鉴定和相对定量分析采用ABI公司的5800MALD1-T0F/T0F蛋白分析仪，质谱分析数据用Protein Pilot 2.0对SWISSPR0T数据库进行检索鉴定蛋白，报告置信度高于95%的蛋白，同时各组检测数据与113报告离子的峰面积积分进行相对定量分析，选择P ^ 0.05的结果进行报告。(6)统计学处理:应用SPSS14.0软件进行统计学分析，计量数据以mean土 SD表示，两样本均数间的比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。3.检测结果:质谱共鉴定到SHBG蛋白5个唯一肽段IALGGLLFPASNLR，QAEISASAPTSLR，LPLVPALDGCLR, SCDVESNPGIFLPPGTQAEFNLR，WHQVEVK，总体覆盖率 22.4%，117/113 = 5.706，118/113 = 6.0681，11当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血清SHBG(Sex hormone‑binding globulin)蛋白作为肺结核病人血清标志物，其特征在于，人类SHBG是由肝细胞合成的同型二聚体血浆糖蛋白，完整的人类SHBG分子是由氨基酸序列完全一致的2条单体组成的同型二聚体，每条单体由373个氨基酸残基组成，分子量为40499D，利用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)结合MALDI‑TOF/MS技术检测涂阴肺结核病人，涂阳肺结核病人，耐药肺结核病人，肺炎病人和正常人的血清，SHBG蛋白在涂阴、涂阳肺结核和耐多药肺结核病人血清中表达水平明显高于肺炎病人和正常人的血清中表达水平，ELISA和免疫组织化学也验证SHBG蛋白在肺结核病人血清和组织中高表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何敏，李翠萍，何晓，李洪涛，臧宁，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西;45