本发明专利技术公开了一种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，所述方法为：将携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液混合，在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下进行转化反应，转化反应结束后，筛选获得含外源基因的乳酸乳球菌的阳性转化子；本发明专利技术所述超声波诱导基因转化方法更加环保，不依赖于细胞型，且转化率和电转化率相当，本发明专利技术转化率达到4.9×103个/μgDNA。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】-种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法 (-)
本专利技术设及外源基因导入微生物的方法，尤其设及一种将构建的含有外源基因的 质粒导入乳酸乳球菌的高效超声波转化方法。 (二）
技术介绍
乳酸乳球菌化actococ州SIactis)是乳品工业发酵的重要菌种，也是騰制蔬菜、 肉制品的常用菌种，在食品加工中有着重要的作用。乳酸乳球菌由于具有生长迅速、易于操 作、安全性高等诸多优点，使其在基因工程疫苗领域成为表达外源蛋白、作为活载体疫苗传 递抗原的最佳选择。人们利用DNA重组技术，使其携带外源基因并表达外源基因产物，从而 发挥更大应用价值。然而，作为革兰氏阳性细菌，乳酸乳球菌细胞壁含有丰富的肤聚糖，细 胞壁较厚，机械强度大，利用传统的化学转化法很难将外源基因导入，故目前广泛采用的是 电转化法。 传统基因转化方法有化学促进法，载体介导法和机械法等，运些方法尽管得到广 泛应用，也取得不菲的成果，但是都有不同程度的缺陷。有的效率低下，有的过程繁冗，有的 成本昂贵，特别是一些细胞只对某一个或某几个方法敏感。而物理方法是基于细胞膜的破 坏来提高通透性，不依赖于细胞型，因此更具有广泛应用价值。超声波是一种传统的细胞破 壁技术，被认为是一种潜在的转化方法。超声波作用细胞可W引起细胞发生多种变化，细胞 变化范围可W是：无明显变化、细胞通透性增加和细胞全溶解。同是物理方法，超声波技术 和电穿孔技术相比也有较直接优势，电穿孔不仅要求有较低的离子介质和较高的电压，并 且接合要求有直接细胞-细胞接触。而超声波没有任何离子介质和电压要求，使得他更有 优势。因此，超声波作为一种机械方法应用更加广泛，且不依赖于细胞型。从理论上讲可W 在细菌、真菌、植物和哺乳动物细胞间转化，目前在哺乳动物和植物中应用较多，而在微生 物上鲜见报道，建立较系统的转化方法，将有很广阔的应用前景。 (H)
技术实现思路
本专利技术提供，该方法新颖、转化 条件溫和、成本低、绿色环境，易于实现基因转化的方法，解决了现有方法转化率低，细胞活 力低，易死亡等问题。 阳〇化]本专利技术采用如下技术方案： 本专利技术提供，所述方法为：将 携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液混合，在28~32°C、超声波场强 200~500W的条件下进行转化反应，转化反应结束后，筛选获得含外源基因的乳酸乳球菌 的阳性转化子；所述乳酸乳球菌感受态细胞悬液是由乳酸乳球菌感受态细胞与冰水预冷的 溶液I重悬而成；所述溶液I组成为：〇. 4~0. 6mol/L薦糖，90~110血/L甘油，溶剂为水。 进一步，所述转化反应在28~32°C、超声波场强200~500W的条件下反应10~ 30min〇 进一步，所述携带外源基因的表达质粒中外源基因为胆固醇氧化酶基因，核巧酸 序列为沈QIDNO. 1所示。 进一步，所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌(Xactococ州SIactis)NZ3900,购自NTCC 典型培养物保藏中屯、，保藏编号NZ3900。 进一步，所述携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液体积比为 1:40-55,所述乳酸乳球菌感受态细胞悬液中湿菌体含量为1XIO7~1X10 8个细胞/ml。 进一步，所述乳酸乳球菌感受态细胞按如下步骤制备：将乳酸乳球菌接种至GM17 培养液中，28~32°C静置培养10-1地，取培养液W体积浓度5%的接种量接种到SGM17培 养液中，28~32°(：静置培养10-1地，再^体积浓度8-12%的接种量转接于56117培养液 中，28~32°C静置培养2-化，将培养液冰浴20~25min后，在4°C、4000-5000r/min条件下 离屯、10-15min，收集湿菌体；将湿菌体用冰水预冷的溶液I重悬，冰上静置20~25min后， 于4°C，4000-5000r/min离屯、10-15min，弃上清，用冰水预冷的溶液II重悬菌体，冰上静置 20~25min后，4000-5000r/min离屯、10-15min，弃上清，用冰水预冷的溶液I重悬菌体，冰 上静置20~25min后，于4°C，4000-5000r/min离屯、10-15min，弃上清，最后用冰水预冷的 溶液I重悬菌体，获得乳酸乳球菌感受态细胞悬液，按50yL/支分装，立即使用或者-80°C 存放；所述Ml7培养基购自英国化Oid公司，所述GMl7培养基组成为：M17培养基+4~6g/ L葡萄糖；SGM17培养基组成为：0. 4~0. 6mol/L薦糖+20~30g/L甘氨酸+4~6g/L葡萄 糖+M17培养基；所述溶液I组成为：0. 4~0. 6mol/L薦糖，90~110血/L甘油，溶剂为水； 溶液II组成为：〇. 4~0. 6mol/L薦糖，90~110血/L甘油，0. 04~0. 06mol/L邸TA,溶剂为 水。 进一步，所述携带胆固醇氧化酶基因的表达质粒为PNZ8149质粒。 本专利技术所述超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，具体按如下步骤进行： (1)乳酸乳球菌感受态细胞的培养和收集 挑取乳酸乳球菌（优选乳酸乳球菌NZ3900)单菌落，接种在5mLGM17培养液中， 28-32°C静置培养lOh，再从其中取出500yL培养液转接于10血SGM17培养液中，28-32°C 静置培养IOh;将8血培养液转接于100血SGM17培养液中，28-32°C静置培养2-化，将培养 液冰浴20min后，离屯、，弃上清；用40血冰水预冷的溶液I重悬菌体，冰上静置20min后， 离屯、，弃上清；用25血冰水预冷的溶液II重悬菌体，冰上静置20min后，离心弃上清；再 用15血冰水预冷的溶液I重悬菌体，冰上静置20min后，离心弃上清；最后加入1血冰水 预冷的溶液I重悬菌体，获得乳酸乳球菌感受态细胞悬液；上述操作的所有离屯、条件均为 4°C，SOOOr/min离屯、lOmin。 似W乳酸乳球菌为宿主的基因转化研究 将乳酸乳球菌感受态细胞悬液与携带胆固醇氧化酶基因的PNZ8149质粒混合，在 抑值至5. 0~6. 0、28~32°C、超声波场强200~500W下，经超声波作用进行转化反应，分 别考察场强和处理时间等参数对转化的影响； (3)阳性转化子的筛选 当转化结束后，取40-50yL转化液，用SGM17培养液定容至1血，冰上放置5min， 28°C静置培养2~化，取培养液涂布于漠甲酪紫筛选培养基平板，30°C培养36h，挑取漠甲 酪紫筛选培养基平板上具有黄色菌斑的单菌落，得到阳性转化子； (4)阳性转化子的鉴定 随机选取筛选平板上的转化子提取基因组DNA，W其为模板，采用特异性引物进行 PCR验证。所用引物：5' -TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3' 和 5'-GCGAATTCTCACTGGATGT 〔664〔6464164-3'。？〇?反应条件为：941：5111111;941：303,551：303,72°(：1111111，30个循环； 72°C5min;凝胶电泳检测重组载体是否插入乳酸乳球菌基因组。 与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在： 1)目前报道多集中在超声诱导植物和动物基因转化，本专利技术拟W超声波方法诱导 微生物基因转化。2)常用的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种超声波辅助外源基因转化乳酸乳球菌的方法，其特征在于，所述方法为：将携带外源基因的表达质粒与乳酸乳球菌感受态细胞悬液混合，在28～32℃、超声波场强200～500W的条件下进行转化反应，转化反应结束后，筛选获得含外源基因的乳酸乳球菌的阳性转化子；所述乳酸乳球菌感受态细胞悬液是由乳酸乳球菌感受态细胞与冰水预冷的溶液Ⅰ重悬而成；所述溶液Ⅰ组成为：0.4～0.6mol/L蔗糖，90～110mL/L甘油，溶剂为水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨胜利，张慧，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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