一种培养后的NKT细胞的冻存液及其制备方法技术

本发明专利技术涉及细胞冻存液技术领域，具体涉及一种培养后的NKT细胞的冻存液及其制备方法，本发明专利技术的培养后的NKT细胞的冻存液包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO，由于其采用自体血清，不存在外源动物病毒的污染及外源蛋白质的引入，安全性高；其中加入的香菇多糖、海藻多糖不仅能够有效的保持细胞的活性，对人体无任何伤害，而且冻存复苏后细胞的状态基本接近冻存前的状态，冻存效果好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞冻存液
，具体涉及一种培养后的NKT细胞的冻存液及其制备方法。
技术介绍
细胞冻存是长期保存维持细胞活性的一种有效方法，其冻存经过低温冷冻保存和超低温冷冻保存两个阶段，低温冷冻保存可以降低细胞的代谢，而超低温(-198℃的液氮中)冷冻保存可以保存活细胞物质代谢和几乎完全停止细胞生长，在超低温冻存时，调节和控制细胞生长代谢的各种酶的活性受到抑制，使细胞内的生化反应十分缓慢，甚至停止，从而保持了细胞的活性。近几年在NKT细胞的表型特征、分布及发育、免疫学效应及与疾病关系、肿瘤治疗和自身免疫性疾病治疗等方面的研究有了很大的发展。由于NKT细胞在肿瘤及免疫性疾病治疗等方面的研究，也决定了NKT细胞培养后冻存的重要性，在治疗方面可以避免延时培养造成的细胞活性低，将最佳状态时期的细胞冻存起来；在经济方面，避免了延时培养造成的成本增加；在研究方面，将不同时期的NKT细胞冻存起来，研究其不同冻存时间的NKT细胞活性。但是如果单纯的冻存，在冻存过程中细胞会受到两个方面的损伤：第一，在冻存的过程中，胞外的水分首先结冰，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，造成细胞死亡，属于渗透性损伤；第二，由于低温导致细胞胞内部形成冰晶会破坏细胞内的结构，属于机械损伤。因此结合以上两点原因，必须解决冷冻的速度，及冻存剂的配方，复苏时融冻的速度也直接影响细胞的活性。细胞冻存液是指用于保护细胞免受冷冻损失的物质，一般可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冻存液主要是小分子物质，易溶于水，与水分子结合能力强，容易通过细胞膜进入细胞内，降低细胞的冰点，提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成，从而减小冰晶的损伤。现有技术中，通常采用添加不同比例的胎牛血清(FBS)和二甲基亚砜(DMSO)配制的冻存液，再进行不同温度和时间的程序降温来冻存培养后的NKT细胞，添加DMSO只是为了从冻存过程中防止胞内冰晶的形成而损伤细胞，而添加FBS是为了保护细胞不受DMSO的损伤和提供营养，但是FBS属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起未知的不良反应，严重影响治疗结果。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供一种临床安全性高，同时又能很好的保持冻存细胞活性的细胞冻存液，用于冻存培养后的NKT细胞。本专利技术还提供一种培养后的NKT细胞的冻存液的制备方法。本专利技术通过以下技术方案实现该目的：一种培养后的NKT细胞的冻存液，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1～3：1，其中：所述溶液A包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO，其中香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO的体积比为1～3：1～3：1～5：1。作为优选的方案，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1～2：1，其中：所述溶液A包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO，其中香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO的体积比为1～2：1～2：1～3：1。作为另一优选的方案，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为2～3：1，其中：所述溶液A包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO，其中香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO的体积比为2～3：2～3：3～5：1。作为优选的，所述香菇多糖的浓度为1～6mg/mL，所述海藻多糖的浓度为0.05～0.2mg/mL。一种培养后的NKT细胞的冻存液的制备方法，包括以下步骤：1)将浓度为1～6mg/mL的香菇多糖和0.05～0.2mg/mL的海藻多糖分别加入自体血清中，再缓慢的加入DMSO，按体积比添加香菇多糖：海藻多糖：自体血清：DMSO为1～3：1～3：1～5：1，将配制得到的溶液A置于2～8℃度冰箱预冷，备用；2)再将上述溶液A取出，将其缓慢加入到自体血清中，按体积百分比添加溶液A：自体血清为1～3：1，配制成NKT细胞冻存液。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术的培养后的NKT细胞的冻存液包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO，由于其采用自体血清，不存在外源动物病毒的污染及外源蛋白质的引入，安全性高；其中加入的香菇多糖、海藻多糖不仅能够有效的保持细胞的活性，对人体无任何伤害，而且冻存复苏后细胞的状态基本接近冻存前的状态，冻存效果好。附图说明图1为冻存前的NKT细胞形态图。图2为冻存后的对照组的NKT细胞形态图。图3为冻存后的实验组1的NKT细胞形态图。图4为冻存后的实验组2的NKT细胞形态图。图5为冻存后的实验组3的NKT细胞形态图。图6为冻存前后的NKT细胞增殖曲线图。图7为冻存前后的NKT细胞杀伤活性曲线图。具体实施方式以下结合附图及具体实施例对本专利技术进行详细描述。实施例1、本实施例提供一种培养后的NKT细胞的冻存液的制备方法，包括以下步骤：1)将浓度为1～6mg/mL的香菇多糖和0.05～0.2mg/mL的海藻多糖分别加入自体血清中，再缓慢的加入DMSO，按体积比添加香菇多糖：海藻多糖：自体血清：DMSO为1～3：1～3：1～5：1，将配制得到的溶液A置于2～8℃度冰箱预冷，备用；2)再将上述溶液A取出，将其缓慢加入到自体血清中，按体积百分比添加溶液A：自体血清为1～3：1，配制成NKT细胞冻存液。实施例2、本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NKT细胞的冻存液，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1：1，其中：所述溶液A包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO，其中香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO的体积比为1：1：1：1，其中，香菇多糖浓度为1mg/mL，海藻多糖浓度为0.05mg/mL。实施例3、本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NKT细胞的冻存液，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为2：1，其中：所述溶液A包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO，其中香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO的体积比为2：2：3：1，其中，香菇多糖浓度为6mg/mL，海藻多糖浓度为0.2mg/mL。实施例4、本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NKT细胞的冻存液，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为3：1，其中：所述溶液A包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养后的NKT细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1～3：1，其中：所述溶液A包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO，其中香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO的体积比为1～3：1～3：1～5：1。

【技术特征摘要】
1.一种培养后的NKT细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液由溶液A和自体血清配
制而成，溶液A和自体血清的体积比为1～3：1，其中：
所述溶液A包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO，其中香菇多糖、海藻多糖、
自体血清和DMSO的体积比为1～3：1～3：1～5：1。
2.根据权利要求1所述的培养后的NKT细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液由溶
液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1～2：1，其中：
所述溶液A包括香菇多糖、海藻多糖、自体血清和DMSO，其中香菇多糖、海藻多糖、
自体血清和DMSO的体积比为1～2：1～2：1～3：1。
3.根据权利要求1所述的培养后的NKT细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液由溶
液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为2～3：1，其中：
所述溶液A包括香菇多糖、海...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，李丽娟，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44