一种用于激活卵巢癌特异性免疫反应的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于激活卵巢癌特异性免疫反应的试剂盒，包括有RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及卵巢癌特异性抗原多肽组合；所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述卵巢癌特异性抗原多肽组合为MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A4-A2/3、NY-ESO-1-A2、PLAC1-A2、CEA-A2、Mamaglobin-A-A3、hTERT-A2、hTERT-A3、Survivin-A2、Survivin-A3及MTA1-A2抗原多肽；本发明专利技术的试剂盒可以高效地以主动诱导/被动诱导相结合的方式激活卵巢癌病人特异性的免疫反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种增强抗癌免疫的试剂盒，尤其涉及一种用于激活卵巢癌特异性免疫反应的试剂盒。
技术介绍
卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。自进入二十一世纪以来，分子生物学与免疫学的长足进步为临床肿瘤治疗提供了新的策略。通过分子生物学的手段已鉴定出大量的肿瘤细胞特异性的抗原，并通过生物信息学的手段分析出其被免疫细胞识别的位点，这为重建患者的肿瘤特异性免疫反应带来的可能。但是最近十年以来的一系列临床试验结果显示，以肿瘤特异性抗原肽为基础的肿瘤疫苗的临床效果令人失望，其中一个重要的原因是抗原提呈过程的缺陷。XiZhao等人用慢病毒感染的DC细胞使其持续性高表达外源性IL12，发现DC.IL12细胞能够高效的诱导抗原特异性CTL细胞的产生，将DC.IL12与肿瘤抗原肽回输至小鼠体内可显著性的缩小肿瘤肿块。感染空载病毒的DC细胞并不能有效的激发相应的免疫反应，回输后对小鼠的肿瘤大小无显著性的影响。该研究提示了高表达IL12的DC细胞对于肿瘤疫苗发挥其抗癌临床作用的重要性。DC细胞是哺乳类动物体内具有抗原提呈能力的一类细胞，其主要功能是摄取、加工处理和递呈抗原，激活或调节适应性免疫应答。T细胞因此被激活而生成MHC-I类限制性CD8阳性细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)和MHC-Ⅱ类限制性的CD4阳性的一型T辅助细胞(type1Thelper,Th1)。一型极化树突状细胞(Type1PolarizedDendriticcell,DC1)是成熟DC细胞的一类亚群，具有强有力的免疫激活能力。DC1细胞的重要的特征是高表达IL12p70以及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特异性的CD8+T细胞和CD4+Th1细胞相关的免疫反应。RobbieB.Mailliard等证实了DC1体外诱导黑色素瘤抗原特异性的CTL细胞的能力可达到正常的成熟DC细胞的40倍以上。AdrianaTLarregina等人还发现DC1细胞诱导B16黑色素瘤抗原特异性CD4+辅助性T细胞，并且促进CD4+辅助性T细胞对肿瘤组织的浸润。因此，高表达IL12的DC1细胞负载肿瘤特异性抗原肽可以为增强抗原肽为基础的肿瘤治疗疗效提供了一种策略，但现有技术中还没有能够相应的、成熟的并适用于激活卵巢癌病人特异性免疫反应的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出一种试剂盒用于卵巢癌的临床治疗。体外诱导肿瘤患者自体的DC细胞，获得富集DC1细胞的产物；DC1细胞负载肿瘤特异性肽段组合，可以用于体外或体内的肿瘤抗原特异性的细胞毒性T细胞的诱导。为了解决上述技术问题，本专利技术所提供的技术措施为：本专利技术提供了一种用于激活卵巢癌特异性免疫反应的试剂盒，包括有RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及卵巢癌特异性抗原多肽组合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述卵巢癌特异性抗原多肽组合包括MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A4-A2/3、NY-ESO-1-A2、PLAC1-A2、CEA-A2、Mamaglobin-A-A3、hTERT-A2、hTERT-A3、Survivin-A2、Survivin-A3及MTA1-A2抗原多肽，其多肽序列分别如SEQIDNo.1，SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6，SEQIDNo.7，SEQIDNo.8，SEQIDNo.9，SEQIDNo.10，SEQIDNo.11及SEQIDNo.12所示。为了进一步优化上述技术方案，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，NK细胞与K562细胞共培养上清通过将K562细胞与NK细胞按1:2至1:10比例共培养并加入IFNα，24小时后收集培养基上清而获得。优选地，所述T细胞培养上清的制备过程中，首先分离外周血单核细胞，淋巴细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞后，接种至培养基中，加入CD3CD28Beads，24h后加入等量培养基，48h后收集T细胞培养上清。优选地，利用试剂盒激活卵巢癌病人肿瘤特异性免疫反应包括以下步骤：步骤一，分离病人外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入诱导剂GM-CSF和IL-4培养两天，培养第3天，第5天更换一半量的培养基，并加入卵巢癌特异性抗原多肽组合，获得负载有卵巢癌特异性抗原多肽组合的成熟DC细胞；步骤二，将所述步骤一中制得的成熟DC细胞用INFγ以及所述的NK细胞与K562细胞共培养上清进一步培养诱导两天，使所述的成熟DC细胞分化为DC1细胞；步骤三，利用步骤二所获得的DC1细胞进行体内主动诱导和/或体外被动诱导。优选地，所述NK细胞来源于人类脐带血。优选地，所述T细胞培养上清为利用自体或异体T细胞获得。优选地，所述步骤三中的体内主动诱导过程为将所述步骤二所获得的DC1细胞回输到病人体内。优选地，所述步骤三中的体外被动诱导过程为将所述步骤二所获得的DC1细胞与T细胞混合培养，并再次负载卵巢癌特异性抗原多肽，然后收集细胞，回输到病人体内。优选地，试剂盒还可以包括GGT551培养基、DMEM/F12培养基或DMEM培养基。本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，本专利技术的技术效果体现在以下几个方面：首先，本专利技术提供了一组用于卵巢癌免疫治疗的特异性抗原多肽组合，该组合包含了多种卵巢癌细胞的特异性表达抗原的肽段。这些肽段包括了HLA-A2与A3呈递的序列区域，覆盖了80％以上的已报道的卵巢癌细胞特异性抗原。因此，我们提供了一种新的卵巢癌特异性抗原多肽组合，有利于激活罹患卵巢癌病人的针对肿瘤细胞的获得性免疫反应。其次，本专利技术还提供了一种利用本专利技术的试剂盒，体外制备成熟DC1细胞，用于负载卵巢癌细胞特异性抗原组合的方法。与常用诱导方案相比，利用本专利技术试剂盒所制备的产物中拥有成熟表型的DC细胞含量显著性提高(如CD80，CD86，CD40L等表面抗原高表达)；经过sCD40L刺激之后，DC1细胞IL12P70表达量大大高于通用方案制备细胞的表达量。由此可见，本专利技术提供了一个更有效成熟DC1细胞制备方案，所得细胞产物可以用于卵巢癌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于激活卵巢癌特异性免疫反应的试剂盒，其特征在于，包括有RPMI‑1640培养基、细胞培养上清、GM‑CSF、IL‑4、INFγ以及卵巢癌特异性抗原多肽组合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述卵巢癌特异性抗原多肽组合为序列如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11及SEQ ID No.12的多肽组合。

【技术特征摘要】
1.一种用于激活卵巢癌特异性免疫反应的试剂盒，其特征在于，包括有
RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及卵巢癌特异性
抗原多肽组合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或
者T细胞培养上清；所述卵巢癌特异性抗原多肽组合为序列如SEQIDNo.1，
SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5，SEQIDNo.6，SEQ
IDNo.7，SEQIDNo.8，SEQIDNo.9，SEQIDNo.10，SEQIDNo.11及SEQ
IDNo.12的多肽组合。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NK细胞与K562细胞共
培养上清通过将K562细胞与NK细胞按1:2至1:10比例共培养并加入IFNα，
24小时后收集培养基上清而获得。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述T细胞培养上清的制备过
程中，首先分离外周血单核细胞，淋巴细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁
珠分选出CD8+T细胞后，接种至培养基中，加入CD3CD28Beads，24h后加
入等量培养基，48h后收集T细胞培养上清。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，利用试剂盒激活卵巢癌病人肿
瘤特异性免疫反应包括以下步...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，叶圣勤，汪鑫，瞿苏，
申请(专利权)人：上海隆耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31