本发明专利技术公开了一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，具体步骤如下：血浆或血清的处理：取外周静脉血置于EDTA抗凝管中室温静置或取自凝全血，1800-2200g离心力下离心4-6min，取上层血浆，加入相同体积的稀释试剂，混匀，在92-97℃下搅拌6-10min，再在15000-17000g离心力下离心8-12min，取上清液为模板做PCR；配置定量PCR反应体系；定量PCR反应。本发明专利技术通过对血浆或血清进行处理，可以直接用血浆或血清进行定量PCR反应，不影响PCR反应，扩增效率与提纯DNA相比一致，减少了DNA提取步骤和实验误差，采用新的荧光染料SuperGreen，可使用较高浓度，荧光信号值高、反应灵敏度高，可精确检测出低至纳克水平的血浆游离DNA，试剂价钱便宜，减少了使用DNA提取试剂盒的费用，操作简便。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及DNA测定
，具体是一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法。
技术介绍
血液循环DNA(CirculatingDNA，ctDNA)，又称游离DNA或无细胞DNA(Cell-freeDNA)，主要来源于细胞的凋亡和死亡。可作为肿瘤、自身免疫病及胎儿遗传学检测的依据。目前的检测方法均需要先从血清或血浆中提取DNA，然后扩增基因组中某个基因的方式，计算ctDNA的浓度或基因组拷贝数。由于个体间、不同病理状态间ctDNA含量及片段完整程度存在较大差异，即便不考虑操作者的因素，所用提取方法和试剂的不同就会造成提取效率存在巨大差别。在此基础上的ctDNA测定结果误差会更大。但直接用血浆或血清扩增，血清或血浆中含有的蛋白质等会严重干扰PCR，使标本间的扩增效率不一致。此外以SYBRGreen为染料的定量PCR技术存在荧光染料信号强度低，灵敏度不高，对于低拷贝数的模板不容易检测到。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种灵敏度高、操作简便的快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案:—种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，具体步骤如下:(I)血浆或血清的处理:取外周静脉血置于EDTA抗凝管中室温静置或取自凝全血，1800-2200g离心力下离心4-6min，取上层血浆，加入相同体积的稀释试剂，混匀，在92-97 °C下搅拌6-10min，再在15000_17000g离心力下离心8_12min，取上清液为模板做PCR ；(2)配置定量PCR反应体系:快速复活热启动DNA聚合酶、SuperGreen染料和2x混合物，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁和三磷酸脱氧核苷，所述三磷酸脱氧核苷包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP，所述dATP，dCTP，dGTP和dTTP的终浓度均为 0.35-0.45mM ；(3)定量PCR反应:用于ROCHE、ABI定量PCR设备，在92-98°C下反应4-6min;92-98°C下反应 4-6s，55-65°C下反应 18_22s，70_74°C下反应 18_22s，重复 45 个循环。作为本专利技术再进一步的方案:所述自凝全血中无添加剂或自凝胶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是:本专利技术通过对血浆或血清进行处理，可以直接用血浆或血清进行定量PCR反应，不影响PCR反应，扩增效率与提纯DNA相比一致，减少了 DNA提取步骤和实验误差，采用新的荧光染料SuperGreen，对PCR扩增过程中的抑制作用更轻微，可使用较高浓度，荧光信号值高、反应灵敏度高，可精确检测出低至纳克水平的血浆游离DNA，试剂价钱便宜，减少了使用DNA提取试剂盒的费用，操作简便，可用于大规模肿瘤高危人群筛查、肿瘤的早期诊断及疗效预后的动态观察。【附图说明】图1为本专利技术实施例4中患者标准量ctDNA的PCR扩增后的荧光信号分析示意图。图2为本专利技术实施例4中ctDNA含量与荧光强度的相关性曲线示意图。图3为本专利技术实施例5中患者标准量ctDNA的PCR扩增后的荧光信号分析示意图。图4为本专利技术实施例5中ctDNA含量与荧光强度的相关性曲线示意图。图5为同一个ctDNA使用不同荧光染料进行PCR扩增后的荧光信号分析示意图。【具体实施方式】下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。实施例1—种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，具体步骤如下:(I)血浆或血清的处理:取外周静脉血置于EDTA抗凝管中室温静置或取自凝全血，1800g离心力下离心4min，取上层血楽，加入相同体积的稀释试剂，混勾，在92°C下搅拌6min，再在15000g离心力下离心8min，取上清液为模板做PCR ；(2)配置定量PCR反应体系:快速复活热启动DNA聚合酶、SuperGreen染料和2x混合物，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁和三磷酸脱氧核苷，所述三磷酸脱氧核苷包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP，所述dATP，dCTP，dGTP和dTTP的终浓度均为 0.35mM ；(3)定量PCR反应:用于R0CHE、ABI定量PCR设备，在92°C下反应4min ;92°C下反应4s，55°C下反应18s，70°C下反应18s，重复45个循环。实施例2—种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，具体步骤如下:(I)血浆或血清的处理:取外周静脉血置于EDTA抗凝管中室温静置或取自凝全血，2000g离心力下离心5min，取上层血楽，加入相同体积的稀释试剂，混勾，在95°C下搅拌8min，再在16000g离心力下离心lOmin，取上清液为模板做PCR ；(2)配置定量PCR反应体系:快速复活热启动DNA聚合酶、SuperGreen染料和2x混合物，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁和三磷酸脱氧核苷，所述三磷酸脱氧核苷包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP，所述dATP，dCTP，dGTP和dTTP的终浓度均为0.4mM ；(3)定量PCR反应:用于R0CHE、ABI定量PCR设备，在95°C下反应5min ;95°C下反应5s，60°C下反应20s，72°C下反应20s，重复45个循环。实施例3—种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，具体步骤如下:(I)血浆或血清的处理:取外周静脉血置于EDTA抗凝管中室温静置或取自凝全血，2200g离心力下离心6min，取上层血浆，加入相同体积的稀释试剂，混匀，在97°C下搅拌lOmin，再在17000g离心力下离心12min，取上清液为模板做PCR ；(2)配置定量PCR反应体系:快速复活热启动DNA聚合酶、SuperGreen染料和2x混合物，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁和三磷酸脱氧核苷，所述三磷酸脱氧核苷包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP，所述dATP，dCTP，dGTP和dTTP的终浓度均为 0.45mM ；(3)定量PCR反应:用于R0CHE、ABI定量PCR设备，在98°C下反应6min ;98°C下反应6s，65°C下反应22s，74°C下反应22s，重复45个循环。实施例4请参阅图1-2，本专利技术实施例中，一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，具体步骤如下:(I)取2-3ml肿瘤患者外周静脉血，置于EDTA抗凝管中，2000g离心力下离心5min，取上层血浆500ul-1000ul，使用Omega公司的游离DNA提取试剂盒提取该病人血浆中游离的DNA，溶解于50ul的H2O中；(2)取1ul提取的血浆DNA，加入90ul的H2O稀释10倍，再取1ul稀释后的血浆DNA，加入90ul的H2O再稀释10倍，依次稀释下去，制备出稀释倍数分别为1: 1、1: 10、I: 100、I: 1000 和 I: 10000 的样品；(3)分别取2ul不同稀释倍数的血浆直接进行定量PCR扩增，PCR体系共20ul，PCR体系包括Iul快速复活热启动DNA聚合酶、Iul的SuperGreen染料、1ul的2x混合物、4ul终浓度为300nM的引物、4ul的H20，使用ROCH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)血浆或血清的处理：取外周静脉血置于EDTA抗凝管中室温静置或取自凝全血，1800‑2200g离心力下离心4‑6min，取上层血浆，加入相同体积的稀释试剂，混匀，在92‑97℃下搅拌6‑10min，再在15000‑17000g离心力下离心8‑12min，取上清液为模板做PCR；(2)配置定量PCR反应体系：快速复活热启动DNA聚合酶、SuperGreen染料和2x混合物，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁和三磷酸脱氧核苷，所述三磷酸脱氧核苷包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP，所述dATP，dCTP，dGTP和dTTP的终浓度均为0.35‑0.45mM；(3)定量PCR反应：用于ROCHE、ABI定量PCR设备，在92‑98℃下反应4‑6min；92‑98℃下反应4‑6s，55‑65℃下反应18‑22s，70‑74℃下反应18‑22s，重复45个循环。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋现让，谢丽，
申请(专利权)人：宋现让，
类型：发明
国别省市：山东;37
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