一种厌氧细菌的分离培养方法技术

本发明专利技术提供一种厌氧细菌在一般实验室条件下的分离和培养方法，先配制透明的密封培养胶及选择性培养胶，再在无菌条件下，将密封培养胶倒入培养皿皿盖内，待冷却凝固后，将待接种的厌氧细菌接种、均匀涂布在密封培养胶的表面并静置，然后加入选择性培养胶直至完全覆盖密封培养胶表面，并在中央微凸起，速将灭菌后的培养皿皿底底部朝下，缓慢放入并轻压，排去气泡；最后，在培养皿皿底和培养皿皿盖之间的缝隙周缘用密封培养胶进行密封，装入事先用75％酒精和紫外灯灭过菌的自封袋中培养。本发明专利技术提供的方法不仅非常简单方便，氧气隔离效果非常好，完全满足厌氧细菌在培养过程中所需的条件，且密封培养胶透明，有利于在培养过程中观察菌落的生长情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了一种厌氧菌的简易培养方法，采用培养皿双反夹屯、法培养厌氧细 菌，此法可应用于大多数厌氧细菌的分离、诊断及计数等研究过程。
技术介绍
细菌在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌株，必需从中把它们分离出来。细 菌分离和纯化的方法很多，但基本原理类似，即将待分离的样品按一定的比例稀释或浓缩， 接种于选择性培养胶，分离培养过程中尽量使细菌的菌落W-定量、分散状态繁殖，并使其 长成一个个纯种单菌落。 阳003]细菌的分离培养一般分为需氧菌的培养、嫌氧菌的培养、一般厌氧菌的培养、严格 厌氧菌的培养。医学及环境监测中对厌氧菌的鉴定、分离培养及计数是常遇到的检验过程， 操作要求高，所需设备及耗材多，分离鉴定成本高。由于部分厌氧菌暴露于空气中极易死亡 的特殊性，病料及检测体在运送过程中的特殊要求、地域及一般实验室条件所限等因素，不 利于厌氧菌的分离鉴定及科学研究工作。 目前，国内外用于纯化厌氧菌培养的方法较多，但都在培养过程中需辅助设备及 大量的试验耗材。一般情况下分为两类，第一类为在厌氧菌培养过程中，需密闭容器，且在 容器中添加特殊药剂（吸氧剂）；第二种方法需要大型的装置或设备，在培养过程中不断通 入COzW隔绝外界环境中的氧气（如CO2培养箱），W上方法培养厌氧菌需一定的实验室条 件，且培养过程中资源耗费较大。所有运些都是依据厌氧细菌均需要一定的厌氧环境培养 运一特点，设法创造一个适合其生长繁殖的条件而进行的。 现有技术中的细菌培养方法在培养细菌过程中的不足之处在于，其一，现有市场 上用于细菌培养的培养皿皿底和皿盖周缘密封都不严，在培养皿双反夹屯、法培养厌氧菌前 期，需用琼脂胶进行灌注密封，W防氧气的渗透进入；其二，在培养后期菌落的选取方面操 作不便，特别是致病菌的选取方面，需分离密封胶与选择性培养胶才能选取特定菌落，给操 作者带来不便。
技术实现思路
本专利技术提供一种利用现有的培养皿通过双反夹屯、法进行厌氧细菌的分离培养方 法，W解决一般实验室没有分离培养厌氧菌的条件，厌氧菌在送检过程中或已死亡，或部分 死亡导致在厌氧细菌的分离培养、计数结果中存在较大误差的技术问题。 为此，本专利技术提供了，包括W下步骤， 阳00引Sl:培养胶的配制 培养胶的配制包括密封培养胶的配制和选择性培养胶的配制两部分，其中密封培 养胶由16g~20g琼脂和IL浓度为0. 9%的生理盐水配制而成；选择性培养胶根据待接种 的厌氧细菌的特性选择不同的培养胶进行配制。现有二氧化碳培养箱中能培养的厌氧细菌 均可作为待接种的厌氧细菌； S2 :厌氧菌的接种及接种面的密封 首先，对培养皿进行灭菌，在无菌条件下，先用所述密封培养胶倒入灭菌后的培养 皿皿盖内底部，待冷却凝固后，将待接种的厌氧细菌接种在密封培养胶表面并涂布均匀，静 置5min~lOmin，W水分渗入密封培养胶内为止；其次，将选择性培养胶灭菌并冷却到45°C 后，倒入培养皿皿盖已涂布好菌种的密封培养胶表面，所述选择性培养胶倒入的厚度完全 覆盖所述密封培养胶，并在中央微凸起，速将灭菌后的培养皿皿底底部朝下，缓慢放入并轻 压，排去气泡；最后，在培养皿皿底和培养皿皿盖之间的缝隙周缘中，缓慢倒入45°C的密封 培养胶进行密封；S3:厌氧菌的培养及菌落的选取 将S2所制得产物装入事先依次用酒精和紫外灯灭过菌的自封袋中进行培养，W 防止培养胶水分散失和空气中杂菌在密封胶周缘的生长，培养时间为12h~72h，对菌落 分类计数；选取菌落时，将培养后的产物倒入较大一点的培养皿中，用摄子轻挑密封培养胶 层，即可选取厌氧细菌的菌落。 优选地，Sl中，所述密封培养胶由18g琼脂和IL浓度为0. 9%的生理盐水配制而 成。 优选地，待接种的厌氧细菌为肠道厌氧菌。 更优选地，待接种的厌氧细菌为瘤胃梭菌、嫌氧性细菌、甲烧菌、硫酸盐还原菌、瘤 胃细菌或纤维素分解细菌。 优选地，S2中，对培养皿进行灭菌时，将培养皿皿底朝下，与培养皿皿盖内部相接 触，包好后在121~126°C条件下灭菌0.化。 优选地，S3中，对所述自封袋内部先用75%的酒精擦试灭菌，再用紫外灯照射比 进一步灭菌。 更优选地，S3中，将S2所制得产物在所述自封袋中培养24h~4她，W防培养基 水分的散失和空气中杂菌在培养皿周缘的生长，也可根据菌落生长情况缩短或延长培养时 间。 本专利技术提供的培养皿双反夹屯、法在进行大量厌氧细菌培养过程中，总结经验，利 用现有的培养皿，创新了一种能在普通实验室环境下进行厌氧细菌培养的新方法，虽然使 用该方法培养厌氧菌与一般需氧菌的培养过程较相似，但本方法不仅非常简单方便，而且 氧气隔离效果非常好，完全满足厌氧细菌培养过程中所需的条件。【具体实施方式】 为了使本领域技术人员更好地理解本专利技术的技术方案能予W实施，下面结合具体 实施例对本专利技术作进一步说明。 阳0巧 1.实验装置： 本专利技术的方法在分离培养厌氧细菌过程中，所用到的装置与一般需氧菌培养方法 所需装置相同，培养容器选用普通的培养皿即可，包好灭菌备用，具体操作过程将培养皿皿 底朝下，与培养皿皿盖内部相接触，包好后在121~126°C条件下灭菌0.化。 2.实验试剂的制备： 由16g~20g的琼脂加入到IL浓度为0. 9%的生理盐水中配制而成，配制成晶奎 透亮的密封培养胶，便于厌氧细菌在培养过程中的观察。对于待接种的厌氧细菌，根据不同 的厌氧细菌种类，采用各自常规方法和要求配制选择性培养胶。 3.厌氧菌的接种、胶封、培养及菌落的选取： 首先，在无菌条件下，先用所述密封培养胶倒入灭菌后的培养皿皿盖内部，待冷却 凝固后，按一定量接种，将待接种厌氧细菌接种于培养皿皿盖内部已经灌注有密封培养胶 的表面，涂布均匀，静置5min~lOmin，静置时间太短不利于水分的吸收，太长可能部分厌 氧细菌会死亡，因此W5min~IOmin为最佳； 其次，将选择性培养胶灭菌，冷却到45°C后，倒入已涂布细菌的密封胶表面，所述 选择性培养胶倒入的厚度完全覆盖所述密封培养胶，并在中央微凸起，速将灭菌后的培养 皿底部朝下，从一侧缓慢放入并轻压，排去培养胶中的气泡； 因培养皿皿底直径较小，与培养皿皿盖间有空隙，最后，在培养皿皿底和培养皿皿 盖之间的缝隙周缘中，缓慢倒入45°C的密封培养胶进行密封； 由于上述方法接种密封后，培养皿的缝隙周缘密封胶暴露在外面，在培养过程中， 将接种密封后的产物装入事先用75%酒精和紫外灯灭过菌的自封袋中进行培养，W防水分 散失和空气中的杂菌生长，培养时间为1化~72h，具体可根据菌落生长情况缩短或延长培 养时间，培养后的厌氧菌菌落生长良好； 因密封培养胶和厌氧细菌选择性培养胶为两种不同培养胶，且为不同凝固时间倒 入，在选取菌落时，将培养后的产物倒入较大一点的培养皿中，用摄子轻挑密封层培养胶， 即可分层选取厌氧细菌菌落。 需要注意的是，上述操作均在无菌条件下进行操作。 阳〇3引实施例1 由0. 9%的生理盐水IL加18g的琼脂而成，配制成晶奎透亮的密封培养胶。筛选瘤胃梭菌用选择型培养胶，主要用于如溶纤维下酸弧菌的分离和培养，由下 列原料制成：肉膏lOg、酵母膏1. 5g、蛋白腺lOg、水溶性淀粉Ig、葡萄糖Ig、醋酸钢5邑^-半 脫氨酸0. 5g、蒸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种厌氧细菌的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤，S1：培养胶的配制培养胶的配制包括密封培养胶的配制和选择性培养胶的配制两部分，其中密封培养胶由16g～20g琼脂和1L浓度为0.9％的生理盐水配制而成，选择性培养胶根据待接种的厌氧细菌的特性选择不同的培养胶进行配制；S2：厌氧菌的接种及接种面的密封首先，对培养皿进行灭菌，在无菌条件下，先用所述密封培养胶倒入灭菌后的培养皿皿盖内底部，待冷却凝固后，将待接种的厌氧细菌接种在密封培养胶表面并涂布均匀，静置5min～10min；其次，将选择性培养胶灭菌并冷却到45℃后，倒入培养皿皿盖已涂布好菌种的密封培养胶表面，所述选择性培养胶倒入的厚度完全覆盖所述密封培养胶，并在中央微凸起，速将灭菌后的培养皿皿底底部朝下，缓慢放入并轻压，排去气泡；最后，在培养皿皿底和培养皿皿盖之间的缝隙周缘中，缓慢倒入45℃的密封培养胶进行密封；S3：厌氧菌的培养及菌落选取将S2所制得产物装入事前依次用75％的酒精和紫外灯灭过菌的自封袋中进行培养，培养时间为12h～72h，培养结束后根据菌落形态和颜色进行分类计数；选取菌落进行菌株鉴定时，将培养后的产物倒入较大一点的培养皿中，用摄子轻挑密封培养胶层，即可选取不同形态的厌氧细菌的菌落。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田发益，
申请(专利权)人：田发益，
类型：发明
国别省市：西藏;54