本发明专利技术公开了抗蓝舌病病毒(Bluetongue Virus，BTV)12型NS1蛋白的单克隆抗体BTV12-NS1-IF8及其识别的B细胞表位和应用。所述的单克隆抗体是由本发明专利技术筛选得到的微生物保藏号为CGMCC No.10207的杂交瘤细胞株分泌产生，实验证明该杂交瘤细胞株分泌的抗BTV12 NS1蛋白单克隆抗体能够与BTV12型NS1蛋白发生特异性反应。此外，本发明专利技术还公开了该单克隆抗体所识别的BTV12 NS1蛋白特异性B细胞表位。本发明专利技术的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的BTV12 NS1蛋白特异性B细胞表位可用于制备鉴别、诊断、预防或治疗BTV12型感染的试剂，同时为以表位为基础的诊断方法建立和表位标记疫苗的设计奠定基础，为进一步研究和治疗BTV12型提供物质储备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，特别设及一株分泌抗蓝舌病病 毒12型NSl蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本专利技术还设及由上 述单克隆抗体所识别的BTV12型NSl蛋白的线性B细胞表位W及上述杂交瘤细胞株、单克 隆抗体W及线性B细胞表位在制备鉴别、诊断、预防或治疗蓝舌病病毒12型感染的相关试 剂与药物中的应用，本专利技术属于蓝舌病的防治领域。
技术介绍
蓝舌病度luetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒度Iuetongue Virus,BTV)引起的反当动物虫媒（如库朦、伊蚊等）传染病。其临诊特征为发热、黏膜水肿 和糜烂等炎症变化。世界动物卫生组织（01巧将BT列为法定通报性疾病，我国将其划定为 一类动物疫病。本病于19世纪在南非的绵羊中首次发现，1905年被命名为"蓝舌病"，由于 BTV中存在大量的基因变异和抗原变异，到目前为止世界上已经发现26种BTV血清型，且各 个血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护作用，运给BT的检测和防控带来了极大的困难。因 此，尽早鉴别诊断爆发的BT血清型并在该病流行区域接种相应的疫苗是防治本病的关键。 我国于1979年在云南首次发现BT流行，之后在湖北（1983年）、安徽（1985年）、四川（1989 年）、山西（1991年）相继爆发本病；同时内蒙古、河北、广东、广西等10个省有BTV血清学 阳性畜检出。在我国已经检测出BTV-1，2,3,4,12,15,16屯个血清型，其中1型和16型是 主要的致病血清型。因此，制备出特异性针对BTV12的Mab,针对BTV12建立一套行之有效 的检测方法就显得十分必要。 蓝舌病病毒度TV)与茨城病毒、鹿流行性出血病病毒、非洲马攝病毒同属环状病 毒属。蓝舌病病毒为双股RNA病毒，呈20面体对称，直径为70-80nm，具有双层衣壳。基因 组由10个大小不同的双股RNA组成，分别编码7种结构蛋白（VP1~VP7)和4种非结构蛋 白（NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4)。外壳蛋白包含VP2和VP5,诱导产生型特异性中和抗体。非 结构蛋白（N巧负责控制BTV复制，成熟和出芽，其中NSl蛋白由S5基因编码，核巧酸长 1689bp，编码552个氨基酸，蛋白大小为64kDa。S5基因在BTV感染宿主过程中具有遗传 和和抗原稳定性。NSl蛋白是在BTV复制周期中表达量最高的细胞质蛋白，其多聚体能够在 感染细胞内中形成大量的病毒特异性微管（直径52. 3nm，1000 nm)，上调包括NSl蛋白的所 有病毒蛋白的合成，形成NSl表达的正反馈，进而迅速增加所有病毒蛋白的合成，使BTV感 染哺乳动物后，病毒蛋白的合成能够迅速取代细胞蛋白的合成，在BTV引起细胞病变的过 程中起重要作用。所W可W通过制备BTV12-NS1蛋白特异性的单克隆抗体并鉴定NSl蛋白 的B细胞表位W建立BTV12的快速准确的鉴别诊断方法并进一步研究预防与治疗措施。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一株分泌抗蓝舌病病毒12型度TV12)NSl蛋白的单克隆抗 体的杂交瘤细胞株； 本专利技术目的之二是提供一种由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体 可与BTV12NS1蛋白发生特异性反应； 本专利技术目的之S是提供一种BTV12NS1蛋白的线性B细胞表位。 本专利技术的上述目的是通过W下技术方案来实现的： 本专利技术利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV12NS1蛋白作为 免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，W祀T-30a原 核系统表达纯化的重组NSl蛋白作为包被抗原建立的间接化ISA方法筛选阳性杂交瘤 细胞，最终获得一株能够稳定分泌抗BTV12NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为 BTV12-NS1-IF8,分类命名为分泌抗BTV12-NS1-IF8单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中 国普通微生物菌种保藏管理中屯、，其微生物保藏号是：CGMCCNo. 10207 ;保藏时间为2014 年12月23日；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。 此外，本专利技术还提供了一种由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，命名为 BTV12-NS1-1F8,IFA检测结果表明该单克隆抗体与重组BTV12NS1蛋白及感染BTV12的 BHK-21细胞发生特异性反应，而与感染BTV1-1LBTV13-24的BHK-21细胞及相应阴性对照 均不发生反应。 进一步的，本专利技术利用肤扫描技术对BTV12-NS1-1F8所识别的BTV12NS1蛋白的线 性B细胞表位进行了鉴定，结果表明：BTV12-NS1-1F8所识别的BTV12NS1蛋白的线性B细 胞表位的氨基酸序列为Sip服AFQLVELAKEAMY?(SEQIDNO. 1所示）。 综上所述，本专利技术制备并鉴定出了一株能够稳定分泌特异性针对BTV12-NS1蛋白 单克隆抗体的杂交瘤细胞，实验证明由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体W及该单克隆抗 体所识别的针对12型BTV的线性B细胞表位可用于制备鉴别或诊断BTV12感染的的试剂 W及预防或治疗BTV12型感染的相关药物，本专利技术的提出为建立BTV12型的鉴别诊断方法 W及进一步研究BTV12型的防治措施奠定了基础。【附图说明】 图1为祀T-30a原核系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白的SDS-PAGE与Western blot鉴定； 1 :pET-30a空载体；2 :重组BTV12-NS1蛋白超声后沉淀；3 :重组BT:12-NS1蛋白 超声后上清；4 :重组BTV12-NS1蛋白诱导后；5 :重组BTV12-NS1蛋白诱导前；6 :纯化后的 重组BTV12-NS1蛋白（SDS-PAGE) ;7:纯化的重组BTV12-NS1蛋白（WB) ;8:未纯化的重组 BTV12-NS1 蛋白（WB);M:标准蛋白Marker。 图2为Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白的 SDS-PAGE与Westernblot鉴定； 1 :重组杆状病毒感染S巧细胞的裂解产物；2 :重组杆状病毒感染S巧细胞的裂 解产物上清；3 :重组杆状病毒感染S巧细胞的裂解产物沉淀；4 :纯化的BTV12NS1蛋白 (SDS-PAGE) ;5 :野生型杆状病毒感染的S巧昆虫细胞；6 :纯化的BTV12NS1蛋白（WB);M:标 准蛋白Marker。 图3为应用IFA检测单克隆抗体BTV12-NS1-1F8与BTV1-24型病毒感染的BHK-21 细胞、未接毒的BHK-21细胞的反应性结果； 1-24 :感染BTV1-24 ;25 :鼠的阳性血清；26 :阴性血清。 图4为应用Westernblot检测单克隆抗体BTV12-NS1-1F8与真核重组重组NSl 蛋白的反应性结果； 1 :感染12型BTV的BHK-21细胞沉淀；2:未感染BTV的BHK-21细胞沉淀；3:真 核重组NSl蛋白；M:蛋白marker 图5为原核表达的55条16氨基酸短肤SDS-PAGE分析； 阳02UM:蛋白质分子量标准；1-55 :表达的55条短肤pNSl-1~pNSl-55。 图6为利用间接E本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株分泌抗蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)12型NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其微生物保藏号为：CGMCC No.10207。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴东来，孙恩成，徐青元，杨涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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