本发明专利技术属于分子遗传学技术领域，尤其涉及一种胰岛组织特异性表达GIPRdn慢病毒载体及其应用。一种胰岛组织特异性表达GIPRdn慢病毒载体，其具有SEQ ID No.1所示的序列。本发明专利技术构建的胰岛组织特异性表达GIPRdn慢病毒载体，包装成病毒颗粒后可以利用绿色荧光蛋白实现目的基因在体内外表达的示踪定位，大大方便了研究人员进行观察研究；慢病毒成功包装并测定病毒滴度。本发明专利技术构建的胰岛组织特异性表达GIPRdn慢病毒载体为下一步生产Ⅱ型糖尿病转基因猪打下基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子遗传学
，尤其设及一种膜岛组织特异性表达GIPRd"慢病 毒载体及其应用。
技术介绍
葡萄糖依赖性促膜岛素多肤（Glucose-dependentInsulinotropic polypeptide,GIP)，具有进食后刺激膜岛素合成分泌，抑制膜高血糖素合成分泌等生理功 能，在维持血糖稳态上发挥了重要作用。GIP具有促进膜岛素分泌并改善其敏感性，上调0 细胞相关基因的表达，促进膜岛P细胞的增殖，延迟膜岛素清除，促进神经修复。GIP的促 膜岛素功能受损是2型糖尿病发病机制的一个重要因素。GIP的促膜岛素功能是通过G蛋 白禪联受体激活腺巧酸环化酶，产生的CAMP激活下游信号通路作用于膜岛0细胞。GIP需 要与其受体GWR结合才能发挥其生物学功能。 GIPR(Glucose-dependentinsulinotropicpolyp巧tiderec巧tor)属于G蛋白 偶联受体超家族，具有7次跨膜结构，作用对象是腺巧酸环化酶。GIP激素从小肠上段分泌 进入血液后，与0细胞表面的特异性的受体（GIPR)结合，使G蛋白的构象改变，激活腺巧 酸环化酶AC,使细胞内的cAMP浓度升高，并活化cAMP依赖的蛋白激酶PKA，并使控制膜岛 素基因表达转录和分泌的关键蛋白质（如CREB)的憐酸化，同时参与膜岛素分泌的调控、配 体分离W及受体敏感性的恢复等过程，从而促进葡萄糖刺激后膜岛素的分泌。 GIPR基因存在缺陷或者功能受损，GIP/GIPR/PKA信号转导通路受到抑制，GIP激 素的分泌量保持不变，但其促膜岛素分泌作用降低，机体血糖浓度升高，诱发2型糖尿病 灯2DM)的发生。制备表达缺陷型GIPR基因（GIPRdn)的转基因T2DM动物模型有助于研究 T2DM的发病机理。 阳0化]膜岛素由膜岛组织特异性分泌，膜岛素基因启动子能诱导外源基因在膜岛0细 胞中特异性表达。构建携带猪膜岛素基因启动子（PIP2)和显性抑制型GIPRd"基因的慢病 毒，保证目的基因在细胞内的高效整合和特异性稳定表达，为后续建立转基因猪提供基础。 公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或W任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术借鉴近年来研究结果加W改进，构建了一种膜岛组织特异性表达GIPRd"慢 病毒载体，本专利技术的最终目的是在膜腺细胞中特异性表达功能缺陷型GIPRd",抑制膜岛素分 析，为后续构建转基因II型糖尿病模型打下基础。 为解决上述技术问题，本专利技术采用W下技术方案： 本专利技术提供了一种膜岛组织特异性表达GIPRd"慢病毒载体，所述的膜岛组织特异 性表达GIPRdn慢病毒载体具有SEQIDNo. 1所示的序列。 本专利技术还提供了所述的膜岛组织特异性表达GIPRd"慢病毒载体在真核细胞中调 控膜岛组织分泌的用途。 阳011] 与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果： 1.本专利技术构建的膜岛组织特异性表达GIPRd"慢病毒载体，包装成病毒颗粒后不仅 能够在真核细胞中，还可W利用绿色巧光蛋白实现目的基因在体内外表达的示踪定位，大 大方便了研究人员进行观察研究。慢病毒成功包装并测定病毒滴度。本专利技术构建的膜岛组 织特异性表达GIPRd"慢病毒载体为下一步生产II型糖尿病转基因猪打下基础。 2.本专利技术的膜岛组织特异性表达GIPRd"慢病毒载体，应用第3代慢病毒系统包装 293FT细胞生成病毒颗粒，通过脂质体进行转染，转染率达90 %W上。 3.本专利技术选择构建W慢病毒为载体的表达系统，能显著提高目的基因转导效率， 而且目的基因整合到宿主细胞基因组的概率明显增加，该载体可W将外源基因有效地整合 到宿主染色体上，从而达到持久性表达。【附图说明】 阳01引 图1为GIPRdnPCR电泳结果； 其中：泳道1-2为GIPRdn的PCR结果；M为Marke巧000。 图2为GIPRd"和pLV的双酶切电泳结果； 阳0化]其中：泳道1-2为pMDlS-T-GIPRdn双酶切；泳道3-4为pLV双酶切；M为Marker化b。 图3为pLV-GIPRdn的菌液Cracking电泳结果； 其中：泳道 1-3 为pLV-GIPRdn质粒；M为superMarker。 图4为pLV-GIPRdn菌液PCR电泳结果； W22] 其中：泳道1-3为GIPRdn的PCR产物；泳道4为对照；M为Marker。 阳02引图5为GIPRdn的测序比对结果。 图6为pLV-GIPRdn质粒的双酶切鉴定； 阳0巧]其中：泳道1-2为pLV-GIPRdn的酶切产物；M为Marker化b。 图7为PIP2和pLV-GIPRdn质粒的双酶切结果； 其中：泳道1-4为PMD18-T-PIP2酶切产物；泳道5为pLV-GIPRdn酶切产物；M为 MarkerIKb〇 图 8 为pLV-PIP2-GIPRdn菌液PCR电泳结果； W29] 其中：泳道1为GIPRdn的PCR产物；泳道2为空白对照；M为Marke2000。 图9为pLV-PIP2-GIPRdn质粒的双酶切鉴定； 其中：泳道1为PLV-PIP2-GWR化的酶切产物；M为Marker化b。 图10为pLV-PIP2-GIPRdn转染0TC-6细胞4化后细胞形态W及巧光表达情况； 其中A为pLV-PIP2-GIPRdn;B为pLVpositivecontrol;C为pLVnegative control;A'、B'、C'为thewhitelightofthecorresponding。 图11为GIPRdn慢病毒包装24、48、7化巧光观察图； 其中：A为病毒包装24h;B为病毒包装4她；C为病毒包装72h;A'、B'、C'分别为 A、B、C对应的白光图。 图12为病毒滴度测定结果图；其中：A为pLV-PIP2-GIPRdn;A' 为白光对照。【具体实施方式】 下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，但本专利技术的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。运些实施例仅用于说明本专利技术，而非用于限制本专利技术的范围。此 夕F，在阅读本专利技术的内容后，本领域的技术人员可W对本专利技术作各种修改，运些等价变化同 样落于本专利技术所附权利要求书所限定的范围。 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 连施例1: 1.1试验材料 1. 1. 1主要试剂及来源 LAMixTap、T4连接酶和EcoRI、BamHI限制性内切酶购自TaKaRa公司； W44] DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自杭州博日生物有限公司； 氨节霉素、氯化钢、氯化钟购自上海华舜生物技术有限公司； 膜蛋白腺、酵母提取物、琼脂粉、氯化钢购自德国OXOID; DNAMarker购自广州东盛生物科技有限公司； 细胞转染试剂、细胞培养基和FBS购自Gibco公司。1. 2试验方法 1. 2. 1人GIPRdn基因序列的合成[005U 人显性抑制的葡萄糖依赖性促膜岛素多肤受体基因（GIPRd")序列是由上海英潍 生物工程有限公司合成，GIPRd"序列大小分别为1377bp。GIPRdn序列比本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胰岛组织特异性表达GIPRdn慢病毒载体，其特征在于：所述的胰岛组织特异性表达GIPRdn慢病毒载体具有SEQ ID No.1所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋钦杨，韦玲静，严雪瑜，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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