一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法。本发明专利技术提供的军团菌快速检测与分型试剂盒，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液,所述PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液含有军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物。本发明专利技术提供的试剂盒具有特异性强和准确性高的优点，该试剂盒可以一步快速检测出是否含有军团菌，同时还可以鉴别出军团菌是嗜肺军团菌还是非嗜肺军团菌，无需进行多次凝胶电泳分析，节省成本，操作简便，而且检测结果准确，是一种理想的军团菌快速检测与分型的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法
本专利技术属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法。
技术介绍
军团菌是一种胞内寄生的革兰阴性杆菌，在土壤和水系统中广泛存在。目前军团菌属有52种包括70多个血清型，并不断有新的菌种从环境中分离。近年来发现，约有一半的军团菌种与人类疾病有关，其中80%以上的军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。军团菌通过空气以气溶胶的形式感染人，引起军团菌性肺炎，严重威胁人类的健康。因此，建立一种能检测军团菌和快速鉴别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的方法具有重要的临床意义。目前对军团菌的检测鉴定方法主要有血清抗体检测、尿可溶性抗原检测、军团菌分离培养等。但是上述的检测方法存在检测时间长、阳性率低、培养基的配置复杂和价格昂贵的缺陷，不利于军团菌的快速检测。近年来，分子生物学的发展为微生物的分类鉴定工作提供了较简便和准确的方法。PCR方法具有很高的特异性与敏感性，其主要是通过检测军团菌中的特异基因，以达到快速检测军团菌的目的。中国专利CN102071247B公开了一种区分非嗜肺与嗜肺军团菌的检测方法及试剂盒，所述的试剂盒组分包括核酸提取液、PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、内参照、阴性及阳性对照，其检测的原理是采用特异性靶序列并根据此设计引物探针并通过荧光PCR扩增，以不同荧光标志的探针实时检测同一靶序列而检测军团菌，并区分非嗜肺与嗜肺军团菌。该检测试剂盒操作简便，可以避免自身PCR产物核酸污染产生的假阳性，而且能解决因样本中PCR抑制剂引起的假阴性的问题。但是，该检测试剂盒对样品要求高，而且检测结果判断复杂，检测结果准确性较低，不利于该试剂盒的推广和应用。中国专利CN101597647B公开了一种军团菌快速检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括细菌组DNA提取液、PCR反应液、PCR产物纯化液和酶切反应液。该试剂盒的是通过应用第一PCR反应液扩增后，以前一步PCR反应产物为模板，用第二PCR反应液扩增，将所得的最终PCR产物作琼脂糖凝胶电泳；将第一PCR纯化液与最终PCR产物混合后加入到PCR纯化柱内，离心后加入第二PCR纯化液，再次离心后，加入第三PCR纯化液后离心，得到PCR纯化产物；将PCR纯化产物加入到酶切反应液中消化，将酶切产物做琼脂糖凝胶电泳检测。该试剂盒具有灵敏度高和特异性高的优点。但是，该试剂盒检测步骤较多，操作繁琐，大大的限制了该试剂盒的应用。因此，研究和开发出一种操作简单、检测结果便于判断、检测结果准确性高的军团菌试剂盒是当前亟需解决的难题。
技术实现思路
为解决现有技术中军团菌试剂盒存在操作繁琐、结果判断复杂和检测结果准确性低的缺陷，本专利技术提供一种军团菌快速检测与分型试剂盒及其检测方法，以解决上述问题。本专利技术提供一种军团菌快速检测与分型试剂盒，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液,所述PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液含有军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物，所述军团菌属特异引物为：GL261F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’(SEQIDNO.1)，GL261R：5’-CGATCTCTACGCATTTCACCG-3’(SEQIDNO.2)；所述嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物为：LP-A628R：5’-GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3’(SEQIDNO.3)，LP-C629F：5’-CTGGGCTTAACCTGGGAC-3’(SEQIDNO.4)。进一步地，所述军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的靶基因均为16srRNA基因。进一步地，所述细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex100resin5%；Tris-HCl10mM，pH8.3；乙二胺四乙酸二钠0.1mM；叠氮钠0.1%；蛋白酶K200μg/ml。进一步地，所述PCR反应液为2×PCR反应液，所述2×PCR反应液的组分及其组分浓度为：0.1U/µlEasyTaqDNA聚合酶；500µMdNTP；20mMTris-HCl，pH8.3；100mMKCl；3mMMgCl2。进一步地，所述PCR引物混合液中军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的浓度比为1-3：1-3，所述军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的浓度比优选为2：1。进一步地，所述阳性对照液还含有嗜肺军团菌基因组DNA，所述军团菌基因组DNA核苷酸序列在NCBI基因库上编号为NR_074231。另外，本专利技术还提供了一种军团菌快速检测与分型的检测方法，包括如下步骤：S1应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA；S2以细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物进行PCR扩增；S3将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增；S4将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。优选地，所述步骤S2中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：94℃3min；阶段2：94℃20s；阶段3：59℃20s；阶段4：72℃25s；35个循环；阶段5：72℃5min；在4℃保温。优选地，所述步骤S2中军团菌属特异引物扩增序列为261bp。其中，GL261F-GL261R引物对扩增序列为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列，具体序列如下：GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG。优选地，所述步骤S2中肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物分别与军团菌属特异引物配对扩增261bp内的一段序列；GL261F-（LPA628R）引物对扩增片段为203bp；（LP-C629F）-GL261R引物对扩增序列为97bp。其中，GL261F-（LP-A628R）引物对扩增片段亦为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列为上述261bp片段内的一段203bp序列，具体序列如下：GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGAC；（LP-C629F）-GL261R引物对扩增序列亦为军团菌属16本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液,所述PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液含有军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物，所述军团菌属特异引物为：GL261F：5’‑GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC‑3’，GL261R：5’‑CGATCTCTACGCATTTCACCG‑3’；所述嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物为：LP‑A628R ：5’‑GTCAACCAGTATTATCTGACCGT‑3’，LP‑C629F ：5’‑ CTGGGCTTAACCTGGGAC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液,所述PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液含有军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物，所述军团菌属特异引物为：GL261F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’，GL261R：5’-CGATCTCTACGCATTTCACCG-3’；所述嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物为：LP-A628R：5’-GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3’，LP-C629F：5’-CTGGGCTTAACCTGGGAC-3’。2.如权利要求1所述的军团菌快速检测与分型试剂盒，其特征在于，所述细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex100resin...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱庆义，詹晓勇，胡朝晖，梁耀铭，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44