一种针对特定大小RNA片段的高通量测序文库构建方法技术

本发明专利技术提供了一种针对特定大小RNA片段的高通量测序文库构建方法，包括以下步骤：去除总RNA中的DNA；去除总RNA中的rRNA；聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶筛选目的大小的RNA；在RNA的3’端连接3’接头；以RNA为模板，加入与3’接头反向互补的逆转录引物进行退火，使3’接头与逆转录引物结合；在RNA的5’端连接5’接头；以RNA为模板，进行逆转录；使用逆转录引物与Index引物进行PCR反应，获得测序文库。上述方法能够去除DNA污染和rRNA对测序数据的影响，同时增加了聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶，达到获取特定大小片段的目的。该方法可广泛用于包括原核小RNA在内的特定大小RNA片段的高通量测序。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及高通量测序文库构建
，具体地说，涉及一种特定大小RNA片 段的高通量测序文库构建方法。
技术介绍
RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链核糖 核酸，其主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁。利用 高通量测序技术对生物样本中的RNA进行测序，能够全面、快速的获得样本的在特定状态 下的转录信息。 目前，RNA测序技术主要集中在真核生物的mRNA测序、小RNA分子测序等，现有的 商业化试剂盒，如NEB RNA文库构建试剂盒、Illumina RNA文库构建试剂盒等方法仅适用 于真核生物，且这些文库构建方法均只能选择具有特定结构的RNA分子，如poly(A)，对于 其大小无法进行选择。因此，需要对现有的文库构建方法进行改进，以实现依赖于特定大小 RNA片段的高通量测序文库构建，如原核小RNA。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种针对特定大小RNA片段的高通量测序文库构建方法，以 实现对原核小RNA等并无特殊结构的特定大小的RNA分子进行高通量测序。 为了实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种针对特定大小RNA片段的高通量测序文 库构建方法，该方法包括以下步骤： (1)去除总 RNA 中的 DNA ; (2)去除总RNA中的rRNA序列； (3)使用聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶筛选目的大小的RNA ; (4)在目的大小的RNA的3'端连接3'接头；以RNA为模板，加入与3'接头反向 互补的逆转录引物进行退火，使3'接头与逆转录引物结合； (5)在RNA的5 '端连接5 '接头；以RNA为模板，进行逆转录； (6)使用P5引物与Index引物进行PCR反应，获得测序文库。 本专利技术方法的步骤（1)中，使用DNase I在37°C下孵育，以消化DNA，实现RNA样 本中DNA的去除。 本专利技术方法的步骤（2)中，使用与rRNA序列相匹配的探针与rRNA结合，以实现 rRNA的去除，具体包括以下步骤：（1)可吸附探针磁珠的制备，使磁珠吸附探针的性能激 活；（2)探针与rRNA的结合，通过在70°C下，RNA的二级结构会打开，当温度降低到25°C时， 探针与rRNA根据碱基互补配对原则退火结合到一起；(3)将可吸附探针的磁珠与退火产物 混合在一起，磁珠在吸附探针时，会将与探针结合在一起的rRNA -同吸附，在磁力架上实 现rRNA的去除。 在步骤（1)的DNase I处理后，需要进行酶失活与纯化操作，本专利技术将酶失活纯化 与步骤（2)结合到一起，在70°C孵育时同时实现了酶失活与RNA二级结构的打开，降低了 RNA在高温下降解的可能性。 本专利技术方法的步骤（2)中的rRNA包括5S、5. 83、163、183、233、263、283、线粒体、叶 绿体rRNA。 本专利技术方法的步骤（3)中，使用高浓度（15% -20% )的聚丙烯酰氨凝胶来实现高 分辨率的RNA分子的分离，通过加入已知片段大小的RNA标记，实现对样本RNA大小的度 量。 在步骤（3)_步骤（5)中，连接作用仅发生在单链RNA分子之间，单链与双链或双 链之间无法连接，以实现在3'端与5'端连接不同的接头，从而最终实现测序的链特异性。 3'接头可以为任何接头，如NEB的3'接头，步骤（4)的逆转录引物与3'接头是反向互补， 步骤（5)的5'接头可以为任何接头，如NEB的5'接头。仅有两端均接上接头的片段在PCR 时会放大。 步骤（6)所述的P5引物与3'接头反向互补，Index引物与5'接头反向互补，Index 引物的3'端与5'接头是反向互补的，其5'端为测序P7端，在两者中间有5-8个标识碱基。 在步骤（6)中，通过在PCR引物上额外的加入5-8个标识碱基，使不同样本在测序时能够区 分开来。 本专利技术提供了上述高通量测序文库构建方法在特定大小RNA片段的高通量测序 中的应用。 本专利技术文库构建过程中文库构建过程中，RNA和DNA均无需打断，可以避免16S、 18S、23S、26S、28S等大片段的rRNA的影响，使测序数据中的rRNA比例降低到10%以下（常 规比例在30%~60% );通过将DNase I消化与rRNA去除结合到一起，减少了纯化操作， 降低了 RNA降解的概率；通过控制连接接头时RNA的5'与3'接头的单链或双链特征，使 RNA的3'仅能连接3'接头，RNA的5'仅能连接5'接头；通过控制3'接头与5'接头的不 同实现测序的链特异性；通过PCR反应将测序的P5端与P7端添加到模板DNA上；通过在 P7端添加5-8个标识碱基，实现不同样品间的识别；通过聚丙烯酰氨凝胶电泳获取特定大 小的RNA片段。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：可以针对特定大 小RNA片段进行文库构建；样本无需打断，可获得全长特定片段文库；不依赖于样本RNA是 否有DNA污染；可以去除99%以上的rRNA序列，使测序数据中的rRNA比例降低到10%以 下；构建的文库具有链特异性。【附图说明】 图IA和图IB分别为本专利技术实施例中样品1去除rRNA前、后的安捷伦2100 RNA Pico芯片不意图。 图2为本专利技术实施例中样品1聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶筛选目的片段电泳示意 图。 图3为本专利技术实施例中样品1进行PCR反应后聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶纯化文库 电泳示意图。 图4为本专利技术实施例中样品1回收切胶产物的质检结果的安捷伦2100 DNA芯片 示意图。【具体实施方式】 下面将结合具体的实施例来进一步说明本专利技术的实施方式及增益效果。 下列实施例中，如无特殊说明，所有的试剂均来自NEB。下列实施例1是对两份烟 草样品（样品1和样品2)进行特定大小RNA片段进行文库构建的流程，具体步骤如下： 实施例1 一、总RNA中DNA的去除 1.采用下列28 μ 1反应体系进行DNA的去除反应： 对上述28 μ 1反应体系进行吹吸混匀，瞬时离心后置于37°C孵育15min。 二、去除DNA后的RNA样品中rRNA的去除 采用Illumina的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，步骤如下： I. RiboZero?磁珠的准备 (1)涡旋混匀已室温平衡30min的磁珠，取225 μ 1至低吸附无 RNA酶的I. 5ml离 心管，置于磁力架2min至上清液澄清，移弃上清液。 (2)从磁力架上取下离心管，加入225 μ L已室温平衡的无 RNA酶水，在管底吹吸十 次混匀，置于磁力架上2min，移弃上清液。 (3)重复该步骤（2) -次，第二次清洗后用10 μ 1枪头将上清液去除干净。 (4)从磁力架上取下离心管，加入65 μ L磁珠重悬液，在管底吹吸十次混匀。 (5)加入 1 μ I RiboGuard RNase 抑制剂，涡旋混匀。 2.探针与rRNA结合形成探针复合物 (1)反应体系当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对特定大小RNA片段的高通量测序文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)去除总RNA中的DNA；(2)去除总RNA中的rRNA序列；(3)使用聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶筛选目的大小的RNA；(4)在目的大小的RNA的3’端连接3’接头；以RNA为模板，加入与3’接头反向互补的逆转录引物进行退火，使3’接头与逆转录引物结合；(5)在RNA的5’端连接5’接头；以RNA为模板，进行逆转录；(6)使用P5引物与Index引物进行PCR反应，获得测序文库。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪坤，刘慧，郭强，方涛，
申请(专利权)人：北京百迈客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11