本发明专利技术公开了一种含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂及其制备方法，该缓释微球制剂是以稳定性保护剂和重组乙肝表面抗原微粒组成内核，由高分子材料聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物作外包封层组合而成；所述稳定剂为海藻糖、人血清白蛋白。其制备方法为：(1）将稳定剂和重组人乙肝表面抗原混合得内水相；（2）将聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中制成油相，取内水相加入油相搅拌匀化；（3）将W/O初乳液加入外水相，搅拌匀化后形成W/O/W复乳液；再搅拌4～6小时，离心洗涤，收集，真空冷冻干燥即可。本发明专利技术可以克服乙肝表面抗原的免疫原性在微球制备和释放过程中被破坏导致抗原变性进而影响免疫效果的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物制剂，尤其是一种含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂及其 制备方法。
技术介绍
乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的世界性传染疾病，它是由乙型肝炎病毒 (HBV)的感染而引起的疾病。目前，接种乙肝疫苗是预防和控制HBV传播的最有效的措施之 一。现在最常使用的乙肝疫苗是由基因重组技术获得的乙肝表面抗原（HBsAg)经纯化、灭 活及加入铝佐剂吸附而成的铝佐剂乙肝疫苗。然而，为了达到持久而有效的免疫应答效果， 铝佐剂乙肝疫苗需在0,1，2个月或0,1，6个月进行三次注射的免疫程序，由于免疫程序复 杂，导致相当一部分人难以完成免疫程序，这种现象在发展中国家更为严重。此外，铝佐剂 乙肝疫苗仅选择性刺激机体产生体液免疫应答，而不能有效诱导产生细胞免疫应答，不能 有效清除细胞内存在的HBV病毒。因而，临床需要研发新型强效乙肝疫苗，简化免疫程序， 使更广泛的人群受到有效的保护。 聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物（PLGA)是一种高分子聚合物材料，将抗原包封在 PLGA微球内可以实现抗原的缓慢释放，制成单次注射缓释微球疫苗制剂。但是，在微球制备 过程中涉及到冷冻干燥和抗原在有机溶剂中分散的乳化过程，这两个过程均容易导致抗原 变性，免疫原性下降。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种单次注射的重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂，以克 服乙肝表面抗原的免疫原性在微球制备和释放过程中被破坏导致抗原变性进而影响免疫 效果的问题。 本专利技术的另一目的是提供一种含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂的制备方法。 本专利技术是这样实现的：含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂，该缓释微球制剂是 以稳定性保护剂和重组乙肝表面抗原微粒组成内核，由高分子材料聚乳酸-聚羟基乙酸嵌 段共聚物作外包封层组合而成；所述稳定剂为海藻糖、人血清白蛋白。 本专利技术中，重组乙肝表面抗原与所述稳定性保护剂的质量比优选为I: (1~20)。 较优选为I: (1~10)，考虑生产成本等影响因素，更优选为1 : 5。 本专利技术中，所述重组人乙肝表面抗原为酵母乙型肝炎表面抗原或中国仓鼠卵巢细 胞分泌的乙型肝炎表面抗原。 本专利技术的含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂的制备方法，包括以下步骤： (1) 将稳定剂和重组人乙肝表面抗原混合得内水相，所述稳定剂为海藻糖、人血清白蛋 白； (2) 将聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中制成油相，取上步所制内水相 加入上述油相搅拌匀化形成W/0初乳液； (3)将W/0初乳液加入外水相聚乙烯醇溶液中，搅拌匀化后形成W/0/W复乳液；再搅拌 4~6小时，离心洗涤，收集，真空冷冻干燥即可。 本专利技术的含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂的制备方法中，重组乙肝表面抗原 与所述稳定性保护剂的质量比优选为I: (1~20)，较优选为I: (1~10)，考虑生产成 本等影响因素，更优选为1 : 5。 本专利技术的含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂的制备方法中，第（2)步中搅拌转 速为8500~20000转/分；以15000转/分为佳；搅拌时间为30~300秒；第（3)步中搅 拌匀化的转速为8500~15000转/分；以12000转/分为佳；搅拌时间为10~20分钟。 本专利技术选用的聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物分子量为4.OXIO3~5. 5X10 4,其 中聚乳酸与聚羟基乙酸（PLA=PLG)的质量比为（50:50)~（85:15)。 本专利技术所说的含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂的制备方法中，所使用的有机 溶剂为二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合液，其中当有机溶剂为二氯甲烷和丙酮的混合液 时，二氯甲烷与丙酮的体积比为75:25。 本专利技术的制备方法中，所述的油相中聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物的浓度为 75~250mg/ml。所述的外水相分散介质聚乙稀醇的浓度为0.5%~5%，可加入浓度为 0~10%的无机盐，以增加抗原的包封率。本专利技术中内水相、外水相的pH值应位于5. 0~ 7. 4之间，内水相、外水相pH值相同，优选6. 0以利终产品的形成。 本专利技术中，收积微球的离心速率为8500转/分，时间大约为20分钟。 本专利技术选择合适的稳定剂保护乙肝表面抗原在微球制备过程中的稳定性；然后使 用生物可降解高分子材料聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物（PLGA)为载体材料包封稳定剂 和重组乙肝表面抗原，制备得到重组乙肝表面抗原的聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物缓释 微球，可以有效保证在微球制备和释放过程中乙肝表面抗原的免疫原性不被破坏。 本专利技术通过添加稳定性保护剂制得的缓释微球，表面光滑，外观均匀，颗粒规则无 粘连，平均粒径在I. 〇 - 10. 〇ym;载药量、包封率高。作为预防乙肝病毒传播的单次注射 缓释微球疫苗制剂，抗原稳定性好，免疫活性高，缓释期超过60天以上，适合于非静脉注射 给药，用于健康人群，提高人群HBsAb水平，又可以诱导细胞免疫，用于清除感染的细胞内 乙肝病毒。因此，本制剂不仅可以作为预防乙肝病毒传播的，又可达到治疗慢性乙肝和乙肝 病毒携带者的效果。另外，乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物微球可生物降解，生物相容性好。【附图说明】图1为本专利技术实施例8所制备的含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂体外释放的 形态变化的扫描电子显微镜照片。图2为本专利技术实施例7和实施例8所制备的含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂 的体外药物释放曲线。 图3为大鼠血清中抗HBsAgIgG抗体水平随时间的变化。 图4为不同制剂诱导产生的大鼠体内IL-2和IFN-y水平。【具体实施方式】 下面通过实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明。 微球的表面特征米用扫描电子显微镜观察。 包封率的测定方法：准确称取20mgHBsAg微球于2ml离心管中，加入Iml乙腈， 14000r.mirT1离心20min，弃上清，将沉淀真空干燥2h后，用Iml磷酸钠溶液（0.02 mol\pH7. 4)重新分散，再次离心，并保留上清液；重复上述过程，合并两次的上清液， 用Lowry法测定HBsAg含量。计算微球的包封率和载药量。微球的包封率=(微球中包封 的HBsAg含量/微球中包封和未包封的HBsAg总量）X100%。微球的载药量=(微球中所 含HBsAg的重量/微球的总重量）X100%。突释率的测定：准确称取20mgHBsAg微球于 2ml离心管中，加入Iml磷酸钠（0. 02mol? 1/ 1pH7. 4)缓冲液，置于37°C恒温摇床，速率 160r?min\ 24h后离心取上清，用Lowry法试剂盒测定其HBsAg含量，计算微球的突释率。 微球的突释率=(20mg微球24h所释放HBsAg的量/20mg微球中HBsAg的总量）X100%。 微球体外释放：分别准确称取20mg所制备的HBsAg-HSA微球与HBsAg微球于2ml 的离心管中，向其中加入Iml磷酸钠（0. 02mol?!/ 1pH7. 4)缓冲液，置于36. 5°C恒温摇床， 速率120转/分，按照预先设定好的时间间隔离心取上清，再在沉淀中加入新鲜的磷酸钠 (0. 02mol? 1/ 1pH7. 4)缓冲液重新置于摇床中摇荡释放。用BCA法试剂盒测定上清液中 总蛋白含量，双抗体夹心ELISA法测上清液中HBsAg抗原活性，体外释放的HBsAg的稳定本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含重组乙肝表面抗原的缓释微球制剂，其特征在于，该缓释微球制剂是以稳定性保护剂和重组乙肝表面抗原微粒组成内核，由高分子材料聚乳酸‑聚羟基乙酸嵌段共聚物作外包封层组合而成；所述稳定剂为海藻糖、人血清白蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马东杰，贺进田，许文娟，侯丽媛，王玮，高珊，张红霞，陈会珍，刘海侠，张彩乔，白燕，张丽丽，李岩异，李宏进，王英，张卫婷，
申请(专利权)人：华北制药金坦生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13
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