本发明专利技术公开了一种虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，讲过甲醇粗提、两次YTX分离提取、YTX纯品的制备等步骤制备得到YTX样品，可用于制作YTX毒素标准品，测定海洋食品（鱼、虾、贝等）中虾夷扇贝毒素YTX的含量，属于海洋食品安全领域必须要检测的指标之一。该方法填补了国内对于贝类毒素标准品缺乏的空白，极大的促进了国内贝类毒素检测技术的发展和海洋食品安全的工作，对于国内海产品顺利出口到欧盟等发达国家，有着很大的促进作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术制备的YTX样品，可用于制作YTX毒素标准品，测定海洋食品(鱼、虾、贝等)中虾夷扇贝毒素YTX的含量，属于海洋食品安全领域必须要检测的指标之一。
技术介绍
已有技术中，有国外文献报道过针对YTX毒素的研究，主要用于YTX毒素的研究，结构的表征，YTX毒素的衍生物的化学结构测定，YTX产毒环境与产毒的关系。国内文献未见对YTX毒素化学分子结构和性质的具体研究。YTX标准品的制备，要求所得到的YTX产品必须有一定的产量，同时纯度达到一定的要求。目前的报道中，YTX的提取主要用于性质分析，提取出的量很小，且纯度不高，无法满足制备YTX检测标准品的需求。同时，现有文献没有涉及到YTX提纯的具体步骤及方法，无法满足制备YTX标准品的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，YTX样品可用于制作YTX毒素标准品，测定海洋食品(鱼、虾、贝等)中虾夷扇贝毒素YTX的含量，属于海洋食品安全领域必须要检测的指标之一。在我国食品安全，海洋产品出口等问题上具有重大的意义。本专利技术的技术方案是这样实现的:虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，步骤如下: 1)甲醇粗提 向装有藻糕的离心管中加入甲醇，超声萃取，离心，收集上清液并过滤；将滤液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净，量体积并放置于-80°C冰箱保存，备用； 2)经过两次分离提取 YTX粗分离: 使用2.4X 32cm层析柱，以70g碱性氧化铝作为填料，CHCl3 - MeOH作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次加入150ml的CHCl3 - MeOH, 150ml的Me0H，Me0H - 1%氨水洗脱，收集MeOH - 1%氨水部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液；将上述洗脱液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，然后将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于-80°C冰箱保存，备用； YTX纯化: 使用2.4X 32cm层析柱，以60g C18作为填料，30%Me0H水溶液作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次用250ml的30%Me0H水溶液，140ml的40%Me0H水溶液，140ml的50%Me0H水溶液，140ml的60%Me0H水溶液，250ml的MeOH，梯度冲洗柱子，收集MeOH部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液，将上述收集液旋转蒸干后加入12ml甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于-80°C冰箱保存，备用； 3)YTX纯品制备 使用半制备液相色谱-紫外光谱联用，以甲醇作为洗脱剂，用250mmX 1mm的半制备柱，5um C18作为填料，在273nm处检测洗脱液的紫外吸收强度，取3.64min处出峰，保留滤液，重复多次提取，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。进一步地，甲醇粗提过程中将收集的上清液先于-80°C冰箱放置过夜，第二天再使用孔径为0.45um滤膜过滤提取液，收集滤液。进一步地，初始洗脱剂洗脱过程为:用弯头胶头滴管，紧贴柱壁转圈上样3ml，开阀，待样品下移至液面相切时，用初始洗脱液淋洗柱壁2-3次，每次约1ml，然后进行梯度洗脱。进一步地，旋转蒸干后加入甲醇淋洗时，用弯头胶头滴管从平底旋转整瓶的瓶劲处不断淋洗。进一步地，纯品制备过程中，重复多次提取，把纯化后收集液全部提取完成，合并取得滤液，旋转蒸发浓缩至2ml ;浓缩后的滤液再次提取，并小心提取3.64min处出峰，合并所提取滤液，得到YTX纯化产品；将YTX纯化产品旋蒸浓缩，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。进一步地，两次分离提取最后溶解液过滤均使用孔径为0.22 μ m的滤膜。本专利技术的有益效果为:本专利技术虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法填补了国内对于贝类毒素标准品缺乏的空白，极大的促进了国内贝类毒素检测技术的发展和海洋食品安全的工作，对于国内海产品顺利出口到欧盟等发达国家，有着很大的促进作用。【附图说明】图1纯品制备过程检测一色谱分离波谱图。图2纯品制备过程检测二色谱分离波谱图图3纯品检测色谱分离波谱图。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解释说明。一、甲醇粗提 1.向装有0.5g藻糕的50mL离心管中加入适量的甲醇，用玻璃棒搅匀，超声萃取15min，3500r/min,离心lOmin，收集上清液，向残渣中加入适量甲醇，反复离心、收集上清液3次。将全部所得上清液于-80°C冰箱放置过夜，第二天使用孔径为0.45um滤膜过滤提取液，收集滤液。2.将上述过滤液旋转蒸发(100rpm/min，，40°C)，蒸干后，分3次，加入12 ml甲醇，使用弯头胶头滴管从平底旋蒸瓶(25mL)瓶颈处不断淋洗，然后超声，直至瓶壁上的溶质溶解干净为止，量体积并放置于-80°C冰箱保存，备用。二、两次分离提取 YTX粗分离 3.使用2.4X 32cm层析柱，以70g碱性氧化铝作为填料，CHCl3-MeOH (1:1)作为初始洗脱剂，粗分离YTX。用弯头胶头滴管，紧贴柱壁转圈上样3ml，开阀，待样品下移致液面相切时，用CHCl3 - MeOH (1:1)淋洗柱壁2_3次，每次约lmL，然后进行梯度洗脱，依次加入CHCl3 - MeOH (1:1，150 ml)，MeOH (150ml)，MeOH - 1% 氨水洗脱。收集 MeOH - 1% 氨水部分，1ml /管，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液。4.将上述收集液旋转蒸发(100rpm/min，40°C )，蒸干后当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，步骤如下：1）甲醇粗提向装有藻糕的离心管中加入甲醇，超声萃取，离心，收集上清液并过滤；将滤液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净，量体积并放置于‑80℃冰箱保存，备用；2）经过两次分离提取YTX粗分离：使用2.4×32cm层析柱，以70g碱性氧化铝作为填料， CHCl3–MeOH作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次加入150ml的 CHCl3–MeOH, 150ml 的MeOH，MeOH–1%氨水洗脱，收集MeOH–1%氨水部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液；将上述洗脱液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，然后将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于‑80℃冰箱保存，备用；YTX纯化：使用2.4×32cm层析柱，以60g C18作为填料， 30%MeOH水溶液作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次用250ml 的30%MeOH水溶液，140ml的 40%MeOH水溶液，140ml的50%MeOH水溶液，140ml的60%MeOH水溶液，250ml的MeOH，梯度冲洗柱子，收集MeOH部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液，将上述收集液旋转蒸干后加入12ml甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于‑80℃冰箱保存，备用；3）YTX纯品制备使用半制备液相色谱‑紫外光谱联用，以甲醇作为洗脱剂，用250mm×10mm的半制备柱，5μm C18作为填料，在273nm处检测洗脱液的紫外吸收强度，取3.64min处出峰，保留滤液，重复多次提取，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨琳，梁玉波，刘仁沿，刘磊，许道艳，李冬梅，
申请(专利权)人：国家海洋环境检测中心，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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