一种锐顶镰孢菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种锐顶镰孢菌及其应用，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：武汉大学内；保藏日期：2014年12月30日；保藏编号CCTCC NO：M2014678。该菌株具有对苏丹红染料的吸附和降解双重作用，研究发现，当在无机盐培养基上添加5％乳糖时，降解效果最明显，28℃培养7d，降解率达到93.72％，作为开发新的生物菌剂，该菌都具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体设及一种锐顶镶抱菌及其应用。
技术介绍
植物内生真菌是一类重要的微生物资源，在新药开发、植物物种保护及与宿主互 作等方面具有重要的商业和科学价值。目前关于细菌对水溶性偶氮类染料的生物降解已经 有诸多报道，但针对非水溶性偶氮类染料的生物降解相关研究较少。 苏丹红是一类人工合成的化学染料，为非水溶性偶氮类化合物，被广泛应用于溶 解剂、机油、蜡、橡胶、鞋油W及纺织品、化妆品等中的着色剂。苏丹红I由于被添加在咸鸭 蛋、辣椒油等食品中有潜在的致癌危害，而引起了广泛的社会关注。研究表明苏丹红I进 入人体后会被肠道微生物的还原酶W及肝脏组织和细胞质内的还原酶代谢成相应的苯胺 类物质，运些苯胺类物质具有强烈的致突变性和致癌性，同时苏丹红类染料工业化的应用 也会导致±壤和城市水体中偶氮类化合物的积累，并随着食物链浓缩对人和动物造成直接 的危害。目前有关水溶性偶氮染料的在厌氧条件下的生物降解已经有了大量报道，在染料 废水的脱色和无害化处理中显示出重要的作用，但生物降解非水溶性偶氮类染料的研究较 少，因而寻找具有降解苏丹红染料的微生物对于解除由于人体和禽类代谢苏丹红有毒中间 代谢产物的积累、明确非水溶性偶氮类染料脱色和降解的新的代谢途径，在有氧条件下降 低此类染料的工业应用给环境带来的污染具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种锐顶镶抱菌及其用于降解苏丹红I的用途。 阳〇化]本专利技术具体通过W下技术方案实现： 一种锐顶镶抱菌化sariumtricinctumB23,该菌株已进行保藏，保藏单位：中国 典型培养物保藏中屯、；地址：武汉大学内；保藏日期：2014年12月30日；保藏编号CCTCC NO：M2014678〇 所述的锐顶镶抱菌培养形态为在PDA培养基上28°C培养，气生菌丝茂盛，棉絮状， 前期为白色，略带淡紫色，后期菌落部分菌丝变黄，菌落后面呈红褐色环状。 所述的锐顶镶抱菌是分离自屯叶一枝花的内生真菌。 本专利技术还包括W锐顶镶抱菌为活性成分的生物菌剂，该菌剂中根据需要可包含本 领域常规的载体和辅料。 本专利技术还提供了锐顶镶抱菌用于降解苏丹红I的用途。降解培养基为：乳糖5g/ 1，K2HPO41. 5g/l，KH2PO40. 5g/l，化Cl0. 5g/l，M拆〇40. 06g/l，FeS〇4 0. 003g/l，（NH4)2S04 lg/1，苏丹红I浓度为10yg/ml，降解溫度为28°C，降解时间为9d。 本专利技术还包括W锐顶镶抱菌为活性成分的生物菌剂用于降解苏丹红I的用途。 本专利技术的有益效果为提供了一种来自于屯叶一枝花的内生真菌锐顶镶抱菌，该菌 株具有对苏丹红染料的吸附和降解双重作用，研究发现，当在无机盐培养基上添加5%乳糖 时，降解效果最明显，28°C培养7d，降解率达到93. 72%。【附图说明】 图1是B23对不同浓度苏丹红I的降解结果； 图2是B23在不同浓度苏丹红I条件下的菌丝生长曲线； 图3是B23在不同浓度苏丹红I条件下的降解曲线； 图4是B23降解谱实验结果； 图5是20°C不同PH条件下菌丝的生长曲线； 图6是20°C不同PH条件下菌丝的水解曲线； 图7是24°C不同PH条件下菌丝的生长曲线； 图8是24°C不同PH条件下菌丝的水解曲线； 图9是28°C不同PH条件下菌丝的生长曲线； 图10是28°C不同PH条件下菌丝的水解曲线； 图11是32°C不同PH条件下菌丝的生长曲线。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，W下所述，仅是对本专利技术的较佳实施 例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述掲示 的
技术实现思路
加W变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术 的技术实质对W下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 实施例1锐顶镶抱菌的分离与鉴定 -、分离 剪取健康植物样品的茎用清水洗净后，在75%乙醇中浸Imin，然后在3. 25%的 化0C1中浸泡5min，再次放入75%乙醇中浸30s，最后用无菌水冲洗5次。样品用无菌吸水 纸吸干后备用。将最后一次洗涂水吸取50yL分别涂布在PDA平板上，置于28°C培养箱培 养3d，观察是否有菌落出现。将表面消毒后的样本接种到PDA双抗培养基上，倒置于28°C 溫箱培养15d，待各植物组织切面长出菌丝后挑取边缘部分移至新的PDA固体培养基上，经 纯化后得内生真菌。最后接种至PDA试管斜面上28°C培养长好后，放于4°C冰箱中备用。二、鉴定 1、菌落及菌丝特征： 将分离得到的菌株在PDA培养基上28°C培养，气生菌丝茂盛，棉絮状，前期为白 色，略带淡紫色，后期菌落部分菌丝变黄，菌落后面呈红褐色环状。 2、rDNA-ITS测定 阳〇3引①样品准备 将分离的植物内生真菌接种于PDA平板，28°C培养4~5天，在转接于250血锥形 瓶中PDB液体培养基中，28°C，150rpm培养4~7天。用纱布过滤获得菌丝，用吸水纸吸干 水分后，取适量菌丝于灭菌的研鉢中，加液氮研磨成粉末。取研磨后的粉末20mg装于1. 5mL 离屯、管中，-20°C保存备用。 W35] ②菌丝基因组DM的提取 采用Ezup柱式基因组DM抽提试剂盒提取： 1)取适量菌丝于预冷的研鉢中用液氮研磨成粉末，取20mg加入1. 5血离屯、管中。 加入 200uLBufferDigestion和 2uLP-琉基乙醇，再加入 20uLProteinaseK溶液， 震荡混匀。56°C水浴比至细胞完全裂解。 2)加入100yLBufferPF，充分颠倒混匀，-20°C冰箱放置5min。 扣室溫1000化pm离屯、5min，将上清转移到新的1. 5血离屯、管中。 4)加入200yLBufferBD，充分颠倒混匀。 5)加入200yL的无水乙醇，充分颠倒混匀。 6)将吸附柱放回收集管中，用移液器将将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸 附柱中，静置2min，再1000化pm室溫离屯、Imin，倒掉收集管中的废液。 7)将吸附柱放回收集管，加入500yLPWSolution, 10000巧m离屯、30s倒掉收集 管中的废液。 8)将吸附柱放回收集管，加入500yLWashSolution, 10000巧m离屯、30s倒掉收 集管中的废液。 9)将吸附柱重新放回收集管中，于1200化pm室溫离屯、2min，去除残留的Wash Solution〇 10)取出吸附柱，放入一个新的1.5血离屯、管中，加入50yL灭菌双蒸水静置 3min，12000巧m室溫离屯、2min，收集DNA溶液。 11)取5yLDNA样品在1 %的琼脂糖凝胶上电泳验证。 W48]直接用于扩增或在4°C保存。（较长时间保存放在-20°C)。 W例③ITS序列的扩增： W基因组DNA为模板，采用真菌一对通用引物。正向引物口S5 :5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，，反向引物口S4 :5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3,。 W53] 采用即用PCR扩增试剂盒扩增，PCR反应体系（50yL) :St本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种锐顶镰孢菌，其特征在于：该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：武汉大学内；保藏日期：2014年12月30日；保藏编号CCTCC NO：M2014678。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：涂璇，邓张双，郭志勇，向贤，邹坤，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42