微囊泡及其制造方法技术

本发明专利技术提供了用于制造微囊泡的方法，所述微囊泡包含：转基因产物和/或包含转基因的慢病毒RNA，所述方法包括以下步骤：培养已在体外使用慢病毒载体导入转基因的细胞以胞外释放包含所述转基因产物和/或所述包含转基因的慢病毒RNA的微囊泡，其中所述慢病毒载体是至少一种结构蛋白基因缺陷的并且在慢病毒基因组序列中包含处于端粒酶逆转录酶(TERT)基因启动子控制下的转基因；以及收集所释放的微囊泡；和根据此方法获取的微囊泡及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及。 背景领域 已知多种细胞在体内分泌或释放微囊泡（小型膜囊泡），例如，外来体。人们已经 认为微囊泡的作用之一是在细胞外释放不必要的细胞内组分。然而近年来，示出了微囊泡 作为信号传递载体在分泌细胞和其靶细胞之间传递诸如蛋白质或脂类的物质并且在细胞 间相互作用中起作用的可能性。 至今已经提出了微囊泡尤其是外来体的多种临床应用。例如，专利文献1公开了 从包含疟原虫属（Plasmodium sp.)抗原的网状细胞中分离的外来体在防御疟疾中的用途。 专利文献2公开了使用来自B细胞的外来体治疗癌症。专利文献3公开了干细胞衍生的微 囊泡在内皮再生或上皮再生中的用途。 慢病毒，例如，人类免疫缺陷病毒（HIV)感染细胞并且具有被整合到分裂细胞和 非分裂细胞两者的基因组内的性质。因此，基于慢病毒基因组序列的慢病毒载体作为基因 转导工具被广泛应用。 引用列表 专利文献 专利文献1 :国际公布TO2011/080271 专利文献2 :国际公布W02011/000551 专利文献3 :国际公布W02009/057165 专利技术概述 技术问题 本专利技术的目的是提供。 问题的解决方案 本专利技术人已经进行了勤勉的研究以达到目的并且因此发现，使用包含处在端粒酶 逆转录酶（TERT)基因启动子控制下的转基因的慢病毒载体将转基因导入细胞可以激活转 基因到宿主基因组的整合和其表达并且可以提高由细胞产生的具有转基因产物的微囊泡 等等的细胞外释放。基于这些发现，本专利技术已经完成。 具体地，本专利技术涵盖以下方面： 用于制造微囊泡的方法，所述微囊泡包含：转基因产物和/或包含转基因的慢 病毒RNA，所述方法包括以下步骤： 培养已在体外使用慢病毒载体导入转基因的细胞以胞外释放包含所述转基因产 物和/或所述包含转基因的慢病毒RNA的所述微囊泡，其中所述慢病毒载体是至少一种结 构蛋白基因缺陷的并且在慢病毒基因组序列中包含处于端粒酶逆转录酶（TERT)基因启动 子控制下的转基因；以及 收集所释放的微囊泡。 根据所述的方法，其中所述细胞不具有所述至少一种结构蛋白基因。 根据或所述的方法，其中所述慢病毒载体是env基因缺陷的。 根据至的任一项所述的方法，其中所述端粒酶逆转录酶（TERT)基因 启动子是人类TERT基因启动子。 根据所述的方法，其中所述人类TERT基因启动子包含SEQ ID NO: 1的核 苷酸序列或与SEQ ID NO: 1的核苷酸序列具有90%或更高的序列同一性的核苷酸序列。 根据所述的方法，其中所述人类TERT基因启动子包含与SEQ ID NO: 1的 核苷酸序列具有95%或更高的序列同一性的核苷酸序列。 根据至的任一项所述的方法，其中所述慢病毒RNA包含转基因上游的 TERT基因启动子序列。 根据至的任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体是： (i)包含慢病毒基因组序列的RNA载体， (ii)编码包含慢病毒基因组序列的RNA的DNA载体，或 (iii)携带包含慢病毒基因组序列的RNA的病毒颗粒。 根据至的任一项所述的方法，其中所述慢病毒基因组序列包含TERT 基因启动子和转基因之间的TERT的转录区域的至少一部分。 根据所述的方法，其中所述TERT转录区域的至少一部分包含SEQ ID N0:2的核苷酸序列或与SEQ ID NO :2的核苷酸序列具有90%或更高的序列同一性的核苷 酸序列。 根据至的任一项所述的方法，其中所述慢病毒基因组序列是HIV基 因组序列。 根据所述的方法，其中所述HIV基因组序列是HIV-I基因组序列。 根据所述的方法，其中所述HIV-I基因组序列包含5'LTR ;包装信号Φ ; gag基因；pol基因；vif基因；vpr基因；tat基因；rev基因；vpu基因和3' LTR。 根据至的任一项所述的方法，其中所述转基因编码蛋白质或RNA。 根据至的任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含为肿瘤抑制 基因的所述转基因。 根据所述的方法，其中所述肿瘤抑制基因是PTEN基因或pl6基因。 根据至的任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体包含编码ShRNA 的所述转基因。 根据所述的方法，其中所述shRNA靶向编码细胞增殖调控因子的基因。 根据所述的方法，其中所述细胞增殖调控因子是CDC6。 根据至的任一项所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。 根据至的任一项所述的方法，其中所述细胞是肾衍生的细胞。 根据至的任一项所述的方法，其中所述细胞是人胚肾293T细胞。 -种微囊泡，包含：转基因产物和/或包含转基因的慢病毒RNA，其中所述微 囊泡是根据至的任一项所述的方法产生的。 基因转导的方法，所述方法包括使靶细胞与根据所述的包含转基因产 物和/或包含转基因的慢病毒RNA的微囊泡接触以融合它们，从而将转基因引入细胞内。 根据所述的方法，其中使所述靶细胞与微囊泡在体外接触。 -种组合物，包含根据所述的微囊泡。 -种药物组合物，包含根据所述的微囊泡。 根据所述的所述药物组合物，所述药物组合物用于治疗癌症。 根据所述的药物组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：结肠癌、 胰腺癌、肾癌、肺癌、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、甲状腺癌和恶性淋巴 瘤。 根据或所述的药物组合物，其中所述癌症涉及⑶C6的表达升高。 根据至的任一项所述的药物组合物，还包含药学上可接受的载体。 -种治疗患者的方法，包括将根据所述的微囊泡施用于需要导入所述 转基因或所述转基因产物的所述患者。 根据所述的方法，其中所述患者患有癌症。 根据所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：结肠癌、胰腺癌、 肾癌、肺癌、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、甲状腺癌和恶性淋巴瘤。 根据或所述的方法，其中所述癌症涉及⑶C6的表达升高。 本说明书包括在美国临时申请号US 61/779, 556和US 61/894, 563中的公开内 容，本申请要求其的优先权。 专利技术效果 本专利技术提供。 附图简述 图1是具有HIV-I骨架的质粒的HIV-I基因组区域的示意图。图IA是pNL4-3的 HIV-I基因组区域的示意图。图IB是pTHTK的HIV-I基因组区域的示意图。 图2示出重组的慢病毒质粒载体pRBL0213T和pTHTN。图2A是显示pRBL0213T 和pTHTN的质粒DNA映射的琼脂糖凝胶电泳图。泳道I :pRBL0213T，EcoR I ;泳道2 : pRBL0213T，Mlu I+Xho I ;泳道 3 :pRBL0213T，Nhe I ;泳道 4 :pTHTN，EcoR I ;泳道 5 :pTHTN， Mlu I+Xho I;泳道M:lkb梯。图2Β是pRBL0213T的HIV-I基因组区域的示意图。图2C是 pTHTN的HIV-I基因组区域的示意图。 图3显示重组的慢病毒质粒载体pRBLOOl。图3A是显示pRBLOOl的质粒DNA映射 的琼脂糖凝胶电泳图。泳道I :pRBL001，EcoR I ;泳道2 :pRBL001，EcoR I+Nhe I ;泳道3 : pRBL001，Mlu I+Xho I;泳道 4:pRBL001，Sal I;泳道 5:pRBL0213T，Nhe I;泳道 M:lkb 梯。 图3B是pRBLOOl的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制造微囊泡的方法，所述微囊泡包含：转基因产物和/或包含转基因的慢病毒RNA，所述方法包括以下步骤：培养已在体外使用慢病毒载体导入转基因的细胞以胞外释放包含所述转基因产物和/或所述包含转基因的慢病毒RNA的所述微囊泡，其中所述慢病毒载体是至少一种结构蛋白基因缺陷的并且在慢病毒基因组序列中包含处于端粒酶逆转录酶(TERT)基因启动子控制下的转基因；以及收集所释放的微囊泡。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：李忠，桂美砂子，冯骆，
申请(专利权)人：李忠，桂美砂子，
类型：发明
国别省市：日本;JP