BTRC基因的过表达试剂及其制备和应用方法技术

本发明专利技术公开了BTRC基因的过表达试剂及其制备和应用方法。选择pcDNA3.1空白载体构建BTRC的过表达载体，酶切pcDNA3.1载体并将BTRC序列插入，得到用于真核表达BTRC的载体质粒。本发明专利技术证实在鼻咽癌细胞株中下调BTRC基因的表达可以促进鼻咽癌细胞的侵袭转移；通过设计并构建BTRC基因的过表达载体，成功地在鼻咽癌细胞中表达BTRC基因，可以有效地抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力，为鼻咽癌治疗提供了新途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体设及BTRC基因的过表达试剂及其制备和 应用方法。
技术介绍
鼻咽癌（化so地aryngealCarcinoma,NPC)是我国南方地区常见的头颈部恶性肿 瘤，由鼻咽粘膜上皮发生恶性转化而来，大多数为低分化鱗状细胞癌，恶性程度高且发病部 位隐蔽，特别是发生在咽隐窝和鼻咽顶部的患者早期症状不明显，因而难W早期发现，误诊 误治率较高；另外鼻咽癌极易发生转移，初诊患者颈部淋己结转移率高达80%。放射治疗 是目前鼻咽癌临床上最常用的治疗手段，60~70 %的患者能取得较好的疗效，但仍有20~ 30%的患者会出现复发和转移。复发和转移是临床上导致鼻咽癌患者死亡的主要因素之 一，且放化疗对治疗鼻咽癌的复发、转移效果不理想，因此，筛选新的鼻咽癌早期转移及预 后判断的分子标记物，对于鼻咽癌的临床治疗有着重要的指导意义，同时相比较传统的放 化疗手段，生物治疗的方法更适合复发和转移鼻咽癌的治疗，其中基因疗法对防治鼻咽癌 的复发、转移具有更重要而广阔的临床应用前景，筛选鼻咽癌基因治疗的祀点也同样意义 重大。 我们通过基因忍片技术，筛选到了BTRC基因（GenebankGeneID:8945 ;参考序列： NM033637. 3)在鼻咽癌中表达下调。迄今为止有关BTRC与鼻咽癌发生发展中的作用的关 系及其在鼻咽癌病人的早期筛查、辅助诊断或者疗效预测等方面均没有文献报道。我们通 过研究表明，BTRC在鼻咽癌组织中的表达水平与鼻咽癌的侵袭转移及预后密切相关，鼻咽 癌组织中BTRC基因表达水平较低的患者更容易复发和转移，因而生存时间较BTRC基因表 达水平高的患者更短。表明BTRC基因可W作为鼻咽癌辅助诊断、疗效预测及预后判断等的 分子标记，针对BTRC设计专用巧光实时定量PCR引物、原位杂交探针及免疫组织化学检测 试剂盒等，用于检测鼻咽癌组织中BTRC的表达水平有望为临床上对鼻咽癌进行复发和转 移的预测提供参考。 此外，我们在鼻咽癌细胞中转染人工合成的BTRC基因干扰序列（siRNA)W抑制 BTRC基因的表达，证实在鼻咽癌细胞株中下调BTRC基因的表达可W促进鼻咽癌细胞的 侵袭转移；通过设计并构建BTRC基因的过表达载体，成功地在鼻咽癌细胞中表达BTRC基 因，可W有效地抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力；通过一系列研究，申请人进一步证实 了BTRC基因编码一个名为P-TrCP化eta-transducinrepeatcontainingE3ubiquitin proteinligase)的E3 泛素蛋白连接酶巧3ubiquitinproteinligase)，P-TrCP是细 胞内蛋白经泛素化途径降解过程中的关键酶之一，可较特异地调控它的底物P-catenin 和Snail经泛素化途径降解，从而维持P-catenin和Snail运两个蛋白在细胞中的含量。 P-catenin、Snail是细胞上皮-间质转换（epithelial-mesenchymaltransition,EMT) 过程中的关键调控因子，而上皮-间质转换又是肿瘤细胞发生侵袭转移的最为关键的第一 步。因此，申请人通过研究证实了鼻咽癌细胞中BTRC表达下调，导致其编码的P-TrCP蛋 白量减少，P-TrCP的底物P-catenin和Snail的降解减慢，造成P-catenin和Snail在 细胞内聚集，推动了鼻咽癌细胞的上皮-间质转换，使鼻咽癌细胞具备更强的侵袭与转移 能力，从而表现为鼻咽癌患者的复发转移，最终导致患者死亡。在鼻咽癌细胞中通过基因工 程的手段重新表达BTCR，则可W明显地抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移能力。因此，BTRC基 因W及其下游包括P-catenin和Snail在内的细胞上皮-间质转换相关信号通路又可W 成为鼻咽癌基因治疗的潜在祀点，特别是BTRC过表达载体在鼻咽癌的基因治疗中具有重 要的应用前景。将BTRC基因过表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒上制成纳米 基因转运体，多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒可保护BTRC基因过表达载体免受核酸酶降解， 延长作用时间，且有更高的转染效率。进而为制备防治鼻咽癌的复发和转移的制剂提供新 的途径。
技术实现思路
阳0化]本专利技术的目的之一是提供BTRC基因的过表达试剂。 本专利技术的目的之二是提供BTRC基因的过表达试剂的制备方法。 本专利技术的目的之S是提供BTRC基因的过表达试剂的应用方法。 阳00引 BTRC基因的过表达试剂的制备方法，制备能够表达BTRC基因的表达载体。选择 PCDNA3. 1空白载体构建BTRC的过表达载体，酶切PCDNA3. 1载体并将BTRC序列插入，得到 用于真核表达BTRC的载体质粒。 构建PCDNA3. 1 - BTRC真核载体步骤如下： 1)W鼻咽癌细胞H肥2的cDNA为模板，利用TaKaRaLATaq愈酶进行PCR扩增 SEQN0 :1所示的全长BTRC编码区序列，BTRC编码区序列扩增引物如下： 上游引物：5 ' -ATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3 ' 下游引物：5, -TTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3'[001引在上、下游引物的5'端分别加上限制性内切酶化eI和EcoRI识别位点及保护 碱基后，引物序列如下： 上游：5'-AGGAGCTAGCATGGACCCGGCCGAGGCGGT-3' ' 下划线部分为Mie I识别位点，下游：5' -ATGCGAATTCTTATCTGGAGATGTAGGTGTATGTT-3'，下划线部分为EcoRI识 别位点； 2)PCR扩增，BTRC编码区序列，PCR反应条件如下： TaKaRaLAT'aq及轉 lj4 说P放上鑛弓I物 0.4轴 lOjim下游引物 0.4叫 cDNA巧板 2.0ul dHaO 巧.2抖1 5x PC民反应缓冲液 4.14 Total 雜jil PCR反应步骤 :斜巧 5min % '.C 10 sec 62'C 撕洗c 72巧彿s斌 返回到第2步，共进行39次反应循环； 阳02U 如将PCR产物电泳、胶回收目的片段后经化eI和EcoRI双酶切后电泳，再次胶 回收； 阳02引 4) PCDNA3. 1质粒经化e I和EcoR I双酶切后电泳胶回收目的片段； 5) W T4DNA连接酶连接4)和5)步胶回收产物，即可得到可用于真核表达BTRC的 载体质粒。 将上述方法制备得到的包含BTRC编码区序列的PCDNA3. 1真核表达质粒转化感受 态大肠杆菌，W扩增质粒。还能将表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒上制成纳米球。 多聚赖氨酸修饰的娃纳米颗粒是运用0P-10、环己烧、氨水的微乳液自组装技术进 行娃纳米颗粒的合成，并利用娃纳米颗粒的表面能和离子静电作用进行多聚赖氨酸表面修 饰，制备得到。 BTRC基因的过表达试剂，是由上述的方法制备得到的。 所述的BTRC基因的过表达试剂的应用方法，用于制备防止鼻咽癌复发和转移的 制剂。 所述的BTRC基因的过表达试剂的应用方法，用于制备BTRC基因表达产物P-TrCP 的底物P-catenin和Snail的降解的制剂。具体是用于制备抑制上皮-间质转换制剂。该 制剂促进BTRC基因的表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
BTRC基因的过表达试剂的制备方法，其特征在于，制备能够表达BTRC基因的表达载体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾朝阳，李桂源，熊炜，晏其佳，李小玲，李夏雨，张文玲，廖前进，陈攀，马健，周艳宏，李征，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43