本发明专利技术涉及一种估算烟草N导入片段右端长度的分子标记、引物及方法。该分子标记为Seq ID No.1 或Seq ID No.2所示序列。本发明专利技术估算方法是以TN5.51引物对或TN5.34引物对为引物以待检测的包含N导入片段的烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置与抗病对照材料Coker176相当；如没有扩增出，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Coker176短。该方法可以简便、快速、高通量地应用于烟草TMV抗病基因定位和选育烟草抗TMV品种中，有利于减少与N基因连锁的累赘。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，特别是设及估算烟草N导入片段右端长度的分 子标记、引物及方法。本专利技术还设及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在烟草TMV 抗病基因定位或选育烟草抗TMV品种中的应用。
技术介绍
烟草花叶病毒病（Tobaccomosaicvirus,TMV)是我国烟草上的重要病害，每年造 成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列。生产上主要采取培育无毒苗、药剂防治和销 毁田间病残体等措施进行防治，在控制TMV的发生流行上取得了一定的效果，但TMV在局部 田块爆发的情况仍然时有发生，造成较大的经济损失。因此，种植TMV抗病品种依然是防控 TMV最根本同时也是最经济有效的手段。抗病品种的推广需要抗性高、且无产量劣势和农艺 性状劣势的品种。 目前烟草的TMV抗源主要来源于烟草野生种屯、叶烟（N.glutinosa)，其抗性由一 个显性单基因（脚控制。N基因在1994年被克隆，是植物中克隆的第一个NBS类抗病基因。 N基因抗TMV-U1株系。N基因的基因组序列大小为6656bp，包括5个外显子和4个内含子， 属于TIR-NBS-LRR类型抗病基因。N基因的抗病机理为在病毒侵染位点出现过敏性坏死斑 (枯斑），通过诱导产生的细胞过敏性死亡限制TMV在植物体内的移动。在介导了过敏反应 后，烟草植株能够获得系统性抗性，对TMV或其它类似病原的再次入侵产生广谱抗性。通过 一系列的常规杂交和回交转育，N基因的抗性从屯、叶烟转育至香料烟中，然后转育至烟草品 种中。采用杂交育种转育N基因的抗性，实际上是转育包含N基因的野生烟染色体片段（简 称为N导入片段）。世界上抗TMV烟草育种利用的几乎都是N导入片段。代表性品种是较 早商业化种植的包含N导入片段的抗TMV烟草品种Cokerl76和Spei曲t肥0。由于产量较 低、上部叶落黄较慢等连锁累寶，包含N导入片段的烟草品种不能满足生产的迫切需要。已 有研究证明N基因本身无产量和产值的连锁累寶，连锁累寶来源于N导入片段上的其他基 因。N导入片段较短的枯斑资源，推测其连锁累寶可能较小，育种利用潜力较大。尽管N基 因在20年前被克隆，但N导入片段的长度和伴随的累寶基因一直不清楚，限制了的N基因 在商业品种中的应用。常规育种技术无法估算N导入片段的长度，产量、落黄和烘烤等性状 为数量性状，在育种早期难W选择。估算烟草N导入片段长度的技术手段缺乏，导致抗TMV 烟草育种缺乏突破性进展。因此如何克服现有技术的不足是目前烟草抗TMV育种
亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种估算烟草N导入片段右端长 度的分子标记、引物及方法，该分子标记、引物及方法可用于筛选N导入片段较短的资源和 育种单株，达到减少N导入片段的连锁累寶的效果，为选育出高抗TMV，且无明显产量和质 量劣势的烟草品种提供技术手段。 本专利技术的目的是提供估算烟草N导入片段右端长度的分子标记。 本专利技术的另一目的是提供一种估算烟草N导入片段右端长度的PCR扩增方法所用 的引物对。 本专利技术的又一目的是提供一种估算烟草N导入片段右端长度的方法。 本专利技术的再一目的是提供上述分子标记、引物对及估算方法在烟草TMV抗病基因 定位或选育烟草抗TMV品种中的应用。 为了实现上述目的，本专利技术采用了W下技术方案： 本专利技术公开了估算烟草N导入片段右端长度的分子标记，所述的分子标记为Seq IDNo. 1 或SeqIDNo. 2 所示序列。 本专利技术还公开了估算烟草N导入片段右端长度的PCR扩增方法所用的引物对，所 述的引物对为TN5. 51引物对或TN5. 34引物对；[001引所述的TN5. 51引物对的序列如下： TN5. 51-F1 :5，-ttcgggtttttagttcggttt-3，（SeqIDNo. 3)， TN5. 51-Rl:5, -aggcaccatgtcacaaaaca-3，(SeqIDNo. 4); 所述的TN5. 34引物对的序列如下： TN5. ：M-F1 :5, -cactttggcctctcacacaa-3'（SeqIDNo. 5)， TN5. ；34-Rl:5，-aaacttgttcatagtctgcgaat-3'（SeqIDNo. 6)。 N导入片段是指包含TMV抗病基因（脚的野生烟染色体片段。N导入片段较短的 烟株，其连累寶可能较小。 本专利技术还公开了一种估算烟草N导入片段右端长度的方法，W上述的TN5. 51引物 对或TN5. 34引物对为引物，W待检测的包含N导入片段的烟草基因组DNA为模板，进行PCR 扩增，扩增产物进行电泳检测，如扩增出对应大小的DNA片段，则表明被检测烟草的N导入 片段在该分子标记位置与抗病对照材料Cokerl76无差异；如没有扩增出对应大小的DNA片 段，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Cokerl76短； N导入片段长度估算：根据N导入片段右端分子标记检测为阴性或阳性，判断N片 段缺失或者包含该标记对应的基因。利用N导入片段的右末端邻近的两个标记检测结果估 算其长度。若内侧标记为阳性，外侧标记检测为阴性，表明该资源的N导入片段末端位于运 两个标记之间，N导入片段的长度用其左右末端阳性标记的基因组物理距离表示。某资源N 导入片段特异分子标记检测阴性越多，则表明该资源的N导入片段越短。[002。其中， 当W权利要求2所述的TN5. 51引物对进行PCR扩增，如果扩增出845bp大小的 DNA片段，即SeqIDNo. 1所示序列的分子标记，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子 标记位置与抗病对照材料Cokerl76无差异；如没有扩增出845bp大小的DNA片段，则表明 被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Cokerl76短； 当W权利要求2所述的TN5. 34引物对进行PCR扩增，如果扩增出648bp大小的 DNA片段，即SeqIDNo. 2所示序列的分子标记，则表明被检测烟草的N导入片段在该分子 标记位置与抗病对照材料Cokerl76无差异；如没有扩增出648bp大小的DNA片段，则表明 被检测烟草的N导入片段在该分子标记位置比抗病对照材料Cokerl76短。 本领域技术人员应该理解扩增产物不仅限于用电泳检测，还可W采用测序的方法 来确定。[002引进一步，优选的是所述的PCR的反应体系如下： DNA模板 50ng/uL 2.5wU 10XPCRbuffer 2.0uL dNTPs2.5mM 1.2yL, 引物对中的引物10umol/L答1.5其L， 巨x-TaqDNA酶 5U/iiL0.3 口L， 过dH游 徐量，总体积为20yL;[002引所述的引物对为TN5. 51引物对或TN5. 34引物对。 进一步，优选的是所述的PCR反应程序：94°C预变性5min;然后进入35个循环： 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s;循环结束后72°C延伸lOmin;4°C保存。 本专利技术的分子标记序列（SeqIDNo. 1和SeqIDNo.。是通过W下技术方 案获得的。利用参考基因组学的方法，W及已测序的含N基因烟草品种TN90基因组 。 利 用烟草抗TMV的本文档来自技高网...
【技术保护点】
估算烟草N导入片段右端长度的分子标记，其特征在于，所述的分子标记为Seq ID No.1或Seq ID No.2所示序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，陈姝敏，李永平，黄昌军，于海芹，肖炳光，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53
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