本发明专利技术涉及一种泥螺多肽在抗前列腺癌中的应用，尤其涉及泥螺多肽在抗前列腺癌DU-145细胞药物的应用。利用胰蛋白酶酶解法获取泥螺多肽粗提物，并且通过超滤法、凝胶柱分离法以及反相高效液相色谱技术等分离纯化手段获得各泥螺多肽组分，分别研究各分离组分对前列腺癌DU-145细胞的增殖抑制性，研究发现各组分均能显著抑制前列腺癌DU-145细胞增殖。本发明专利技术原料成本低，提取条件简单温和，提取的泥螺多肽对前列腺癌DU-145细胞增殖抑制效果显著，为开发以泥螺多肽为原料的抗前列腺癌药物提供理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及泥螺酶解多肽的应用，具体涉及。
技术介绍
泥螺（Bullactaexarata)，俗称"吐铁"、"黄泥螺"、"梅螺"等，属软体动物门、腹足 纲、后鳃亚纲、头楣目、阿地螺科、泥螺属，为太平洋西岸海水及咸淡水特产的种类，由贝壳 和软体两部分组成，含有丰富的蛋白质、钙、磷、铁和维生素等成分，多肽物质丰富，在我国 广泛分布于东海和黄海两侧的长江，是一种常见的水产品。 恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，发病率越来越高，目前已有的 化疗药物虽对大多数肿瘤有一定的疗效，但选择性差、毒副反应大、耐药性等问题依然非常 明显。因此，寻找高效、低毒、特异强的抗肿瘤药物仍势在必行。多肽因其分子量小、无免疫 原性、活性高、副作用小，尤其是对多药抗性的肿瘤细胞系也有很好的抑制活性。海洋生物 多肽是目前海洋生物活性物质研究的一个重要领域，一些生物活性多肽常以非活性状态存 在于蛋白质中，这些蛋白质经过蛋白酶的水解作用，使得隐藏于其中的活性肽释放出来，有 可能发挥出比蛋白质更多的生物活性。例如：如邓伟等发现藻蓝蛋白酶解多肽对人宫颈癌 HeLa细胞株的体外生长有明显的抑制作用；杨永芳等酶解紫贻贝所得的紫贻贝多肽对前 列腺癌PC-3细胞和DU-145细胞有特异性的增殖抑制作用，并且对DU-145细胞的抑制作用 强于对PC-3细胞的增殖抑制作用；姚如永等研究泥蚶多肽在0. 25-1.Og?L1范围内，多肽 能明显的抑制肺癌细胞A549和Ketr-3细胞的增殖，同时还能抑制细胞蛋白质的合成，并呈 明显的剂量依赖性。 前列腺癌为男性高发的恶性肿瘤，其死亡率高居癌症死亡率的第二位，仅次于肺 癌。近年来，随着人们生活方式的改变、人口的老龄化以及诊断水平的不断提升，我过前列 腺癌的发病率明显呈上升趋势。前列腺癌DU-145细胞是从前列腺癌脑转移肿瘤中分离出 来的，分化程度低，为雄激素依赖的前列腺癌细胞，具有强大的转移潜能，缺乏内源性的雄 激素受体的表达。DU-145细胞完全贴壁的时间通常为24h内，具有较强的侵袭和促血管新 生能力。研究泥螺酶解多肽多前列腺癌DU-145细胞的抑制作用，对前列腺癌药物的理论研 究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在酶解泥螺组织获取泥螺多肽的基础上，提供一种泥 螺多肽在抗前列腺癌药物中的应用，尤其是抗前列腺癌DU-145细胞。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种泥螺多肽在抗前列腺癌 DU-145细胞药物中的应用，前列腺癌DU-145细胞是从前列腺癌脑转移肿瘤中分离出来的， 分化程度低，为雄激素依赖的前列腺癌细胞，具有强大的转移潜能，缺乏内源性的雄激素受 体的表达，其中药物的具体实现形态可为片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂等。 上述的泥螺多肽通过以下步骤制得：新鲜泥螺洗净去壳，取泥螺组织捣碎，加入蒸 馏水匀浆，料液比为I: (3~4)，匀浆后调节匀浆液的pH值为8~9,加入0. 4~0. 5%匀浆 液体积的胰蛋白酶，40~50°C保温水解7~9h，水解完成后95~KKTC、10~15min进行 灭酶，4°C下水解液于9500~10000r/min离心15~20min，取上清液浓缩干燥得酶解粗提 物，将酶解粗提物溶于蒸馏水，分离纯化得各泥螺多肽组分。 上述酶解粗提物的浓度在5~25mg/ml时，对DU-145细胞增殖抑制指数为36. 9~ 80. 7%，且增殖抑制指数与酶解粗提物的浓度呈正相关。 上述分离纯化步骤为超滤或依次为超滤和凝胶层析或依次为超滤、凝胶层析及反 相高效液相色谱。 进一步，所述超滤步骤中使用10kd、5kd及3kd超滤膜，分别获得分子量为10~ 5kd的组分Al,分子量为5~3kd的组分A2以及分子量小于3kd的组分A3, 20~25mg/ml 组分A3作用于DU-145细胞36h后的增殖抑制率为77~78%，且增殖抑制指数与组分A3 的浓度呈正相关。 再进一步，所述凝胶层析中对组分A3进行洗脱，分别获得Hl组分、H2组分和H3 组分，其中5~20mg/ml组分H2作用于DU-145细胞24h后的增殖抑制指数为为44. 1~ 81. 6%，且增殖抑制指数与组分H2的浓度呈正相关；凝胶层析条件：选用S印hadexG-25凝 胶层析，装柱后用去离子水平衡，浓度为50mg/mL、上样4mL、速度为3ml/min，流动相为超纯 水，280nm紫外检测。 又再进一步，采用反相高效液相色谱分离所述H2组分，分离获得组分Fl和F2， 其中2. 5~3mg/ml组分Fl和组分F2作用于DU-145细胞24h后，对DU-145细胞的增 殖抑制率分别为31~33. 72 %和40~42. 04% ;反相高效液相色谱条件：选用Zorbax SB-C18 (4. 6X250, 5um);柱温为20°C;流动相为1 %TFA和乙腈；梯度洗脱：从开始到30min 结束，乙腈浓度从0变化到40%，洗脱速度为I.OmL/min;进样体积为50ul紫外检测波长分 别为 214nm、280nm。 上述组分Fl的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所述，组分F2的氨基酸序列如SEQID NO. 2所述。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于：前列腺癌是一种严重影响男性健康的恶性 肿瘤，本专利技术通过胰蛋白酶酶解泥螺组织获取酶解粗提物，然后通过分离纯化手段获取泥 螺多肽的多种组分，研究各组分对前列腺癌DU-145细胞的影响。本专利技术中采用的泥螺为一 种低值贝类，原材料成本低，并且泥螺多肽的提取方法工艺简单，反应温和，提取获得的泥 螺多肽各组分对前列腺癌DU-145细胞的增殖抑制效果显著，其中组分H2对DU-145细胞的 IC5。为I. 32mg/ml，为开发以泥螺多肽为原料的抗前列腺癌药物提供理论依据。【附图说明】 图1为实施例4中泥螺酶解粗提物对前列腺癌DU-145细胞的抑制率； 图2为实施例4中膜分离组分对DU-145细胞的抑制率； 图3为实施例4中A3组分经Sephadex G-25柱层析曲线； 图4为实施例4中凝胶层析组分对DU-145细胞的抑制率的折线图； 图5为实施例4中凝胶层析组分对DU-145细胞的抑制率的柱状图； 图6为实施例4中H2组分的反相高效液相图谱； 图7反相高效液相色谱纯化的组分对DU-145细胞的抑制率。【具体实施方式】 以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。 实施例1 :泥螺多肽的制备 (I. 1)原料处理 取新鲜泥螺，将泥螺去壳、浙干后匀浆备用。 (1. 2)泥螺酶解工艺 用高速组织捣碎机将泥螺组织捣碎匀浆，精密称取匀浆液，用0.lmol/L的盐酸 溶液和〇.lmol/L的NaOH溶液调pH值，加入胰蛋白酶酶解数小时，酶解条件为酶解温度 45°C，pH为8. 7,料液比1:4,酶解时间8h，加酶量0. 48%。KKTC下灭酶15min，4°C下离心 15min(10000r/min)，取上清液浓缩备用。 实施例2 :DU_145细胞的培养和传代 (2. 1)细胞复苏 从液氮罐中取出存放的DU-145细胞株，快速的放入37°C恒温水浴锅中进行融化， 待融化后进入无菌工作室进行操作，用灭菌好的吸管将细胞株吸入离心管，加入2mL的F12 营养液或RP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种泥螺多肽在抗前列腺癌DU‑145细胞药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：闻正顺，马剑茵，曹玉昊，林焕乐，胡俊峰，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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