本发明专利技术提供了一种检测BRCA1和BRCA2突变的方法和试剂盒。本发明专利技术的方法和试剂盒使用了两套PCR引物，第一套PCR引物包括189对PCR引物，分两组，第一组包括引物95对(SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.194)，第二组包括引物94对(SEQ ID NO.195-SEQ ID NO.382)，每个上游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.1，每个下游引物的5’端添加序列SEQ ID NO.2；第二套PCR引物的上、下游引物序列是SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及基因突变检测领域，尤其设及基因突变多重PCR检测。
技术介绍
BRCA1和BRCA2是两个具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、 遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。已发现的BRCA1和BRCA2的突 变有数百种之多，有些与遗传性乳腺癌和卵巢癌有关。总结BRCA1和BRCA2基因突变相关 的癌症的终身风险显示，有BRCA1基因突变者患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50% -85% 和15% -45%，有BRCA2基因突变者患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50 % -85 %和 10% -20%。与普通妇女相比，运些都是很高的患癌几率。 由于BRCA1和BRCA2基因的突变对家族性乳腺癌、卵巢癌的发生有一定的联系，所 W检测BRCA1和BRCA2的突变基因对相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的临床意义。另 夕F，由于BRCA1和BRCA2的突变众多，检测运些突变对于相关基因的研究十分有意义，例如 对于基因多态性分析和家族进化史研究。 目前，普遍应用的BRCA基因突变检测方法主要为限制小片段长度多态性分析法 (RFLP法）和DNA直接测序法。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法，该方法存在 W下缺点：实验操作繁琐、检测周期长、成本高、存在第一轮酶切不完全导致的假阳性、非闭 管操作、易于污染、难W满足临床检测要求。DNA直接测序法存在W下缺点：检测周期较长、 成本高、非闭管操作、难W避免交叉污染、通量不高。另外，DNA直接测序的灵敏度较低，杂 合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，通常需要 多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法也难适用于临床检测。 阳0化]也有已公开专利使用PCR方法来检测乳腺癌易感基因突变，例如专利"检测乳腺 癌易感基因突变的多重PCR试剂盒及其制备方法"（授权公告号：CN101200766B)。但是， 该专利所用的多重PCR仅限定在BRCA1和BRCA2基因部分外显子上的部分突变位点上，而 运明显不能覆盖BRCA1和BRCA2基因遍布在多个外显子上的上百种突变，因此该专利在使 用上有较大局限。 因此，本领域需要可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRCA1和BRCA2基因突变 的方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提供可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRCA1和BRCA2突 变的方法和试剂盒。本专利技术主要是利用多重PCR技术对BRCA1和BRCA2基因编码区进行捕 获富集，然后通过高通量测序技术测定富集后的编码区序列，最终通过生物信息学分析高 通量测序数据，从而发现编码区的突变情况及其频率。 阳00引因此，本专利技术提供了一种检测BRCA1和BRCA2突变的方法，所述方法包括 1)捕获进行第一轮特异性多重PCR反应，使用189对引物对样品DNA进行扩增， 所述189对PCR引物分两个试管进行反应，第一个试管引物95对（SEQIDNO. 5-SEQID NO. 194)，第二个试管引物94对（SEQIDNO. 195-SEQIDNO. 382)，每个上游引物的5'端添 加序列SEQIDNO. 1 : "ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAC"，每个下游引物的 5' 端添加序列沈Q IDNO. 2 :"GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTA"; 2)建库：进行第二轮PCR反应，使用PCR引物对：上游引物沈QIDNO. 3:"AATGAT ACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC"，下游引物沈QIDNO. 4: "CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGTTGTGACTGGAGTTCAGACGT"对步骤 1)获得的 扩增产物进行扩增； 3)测序，对步骤2)获得的扩增产物进行测序； 4)分析，对步骤3)获得的测序结果进行分析，完成全编码区的突变检测。 本专利技术还提供了一种BRCA1和BRCA2基因突变多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒 包括：两套PCR引物和PCR扩增预混和溶液（例如，来自KAPA2G化St热启动多重扩增试剂 盒）； 所述的两套PCR引物，第一套PCR引物包括189对PCR引物，分两组，第一组包括 引物 95 对（SEQIDNO. 5-SEQIDNO. 194)，第二组包括引物 94 对（SEQIDNO. 195-SEQID NO. 382)，每个上游引物的5'端添加沈QIDNO. 1 : "ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAC"序列，每个下游引物的 5' 端添加沈Q IDNO. 2 :"GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTA"序列； 阳0化]第二套PCR引物的上游引物序列沈QIDNO. 3是： "AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC"，下游引物序列沈QID NO. 4 是 "CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGTTGTGACTGGAGTTCAGACGT"。[002U 在本专利技术的试剂盒中，所述第一套为特异性多重PCR引物，所述第二套PCR引物是 一对常规PCR引物，在其5'端带有测序序列。 在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括蒸馈水。 在一个优选的实施方案中，所述的试剂盒中，第一套引物的PCR反应的反应体系 按如下比例配制：第一套PCR引物10份、PCR扩增预混和溶液（例如PCR扩增预混和溶 液）12. 5份、DNA模板3份、水4. 5份。 在一个优选的实施方案中，第二套PCR反应的反应体系按如下比例配制：第二套 PCR引物2. 5份、PCR扩增预混和溶液（例如PCR扩增预混和溶液）7. 5份、第一轮PCR回收 产物5份、水4. 5份。 和现有技术相比，本专利技术的检测方法和试剂盒具有如下优点： 1)成本低廉； 2)对待检测样品要求量低，可对血浆和血清中的极低DNA样品进行分析；[00測扣地毯式引物设计，可实现全编码区突变检测，不但能对已知突变进行分析，还能 发现新的突变； 4)灵敏度高； 5)检测时间短，结合高通量测序技术，可短时间内实现全编码区突变检测。 本专利技术的试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRCA突变，协助临床医生 实现肿瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险W及患者负担。 应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当 用作对本专利技术所要求保护内容的限制。【附图说明】 参考随附的附图，本专利技术更多的目的、功能和优点将通过本专利技术实施方式的如下 描述得W阐明，其中： 图1 :第二轮PCR反应经过2 %琼脂糖电泳鉴定结果。【具体实施方式】 通过参考示范性实施例，本专利技术的目的和功能W及用于实现运些目的和功能的方 法将得W阐明。然而，本专利技术并不受限于W下所公开的示范性实施例；可W通过不同形式来 对其加W实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本专利技术的具体细节。 本专利技术提供了一种检测BRCA1和BRCA2突变的方法，虽然在某些情况下，对运些基 因的检测对于相本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测BRCA1和BRCA2突变的方法，所述方法包括1)捕获：进行第一轮特异性多重PCR反应，使用189对引物对样品DNA进行扩增，所述189对PCR引物分两个试管进行反应，第一个试管引物95对SEQ ID NO.5‑SEQ ID NO.194，第二个试管引物94对SEQ ID NO.195‑SEQ ID NO.382，每个上游引物的5’端添加序列SEQ IDNO.1，每个下游引物的5’端添加序列SEQ IDNO.2；2)建库：进行第二轮PCR反应，使用PCR引物对：上、下游引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4对步骤1)获得的扩增产物进行扩增；3)测序，对步骤2)获得的扩增产物进行测序；4)分析，对步骤3)获得的测序结果进行分析，完成全编码区的突变检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：屈武斌，杭兴宜，蔡万世，
申请(专利权)人：艾吉泰康生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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