L-苏氨酸基因工程生产菌制造技术

本发明专利技术通过基因工程构建了一种L-苏氨酸生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015556。本发明专利技术所构建的L-苏氨酸生产菌在发酵过程中不需要添加任何氨基酸就能够实现发酵液中L-苏氨酸的有效积累，提高了L-苏氨酸的产量及糖酸转化率，降低了生产成本，具有广阔的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
L-苏氨酸基因工程生产菌
本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及一种L-苏氨酸基因工程生产菌。
技术介绍
L-苏氨酸作为八种必需氨基酸之一，在人和动物的生长发育中起着重要的作用，因而被广泛用于饲料添加剂、食品工业及医药产品等方面。L-苏氨酸的制备方法主要有蛋白质水解法、化学合成法、酶法和发酵法，前三种方法都由于存在着诸多弊端，不能实现工业化生产。而发酵法由于成本低、污染小等优点，已成为生产L-苏氨酸的主要方法。上世纪50年代，日本最早采用添加前体物的方法通过发酵来生产苏氨酸，在60年代已有通过直接发酵法生产L-苏氨酸的报道，是利用诱变育种筛选的黄色短杆菌通过发酵生产出L-苏氨酸。上世纪70年代末，苏联已开始用基因工程菌大规模生产L-苏氨酸。传统的发酵法大多采用诱变的黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌等，通过解除菌体自身的反馈调节，切断支路代谢，增加前体物的合成等手段，以提高L-苏氨酸产量。Shiio(IsamuShiioandShigeruNakamori.AgrBioChem.1969,33(8):1152)等利用黄色短杆菌，经α-氨基-β-羟基戊酸处理后，获得了L-苏氨酸生产菌株，苏氨酸的产量累积达13.58g/L。Nakamori等(ShigeruNakamoriandIsamuShiio.AgrBioChem.1972,36(7):1209)在此菌株基础上，选育出了L-蛋氨酸缺陷型变异株，产量提高到了18g/L。但传统诱变育种由于随机性较强，获得高产突变株的难度较大。利用合理的代谢工程方法构建L-苏氨酸工程菌，是目前获得高产菌株的首选方法。日本味之素2002年申请的中国专利CN01137078.5中，利用大肠杆菌，通过增强苏氨酸合成代谢途径上相关基因的表达，使苏氨酸产率达0.43g/g(葡萄糖，糖酸转化率为43％)，但发酵过程中需要额外添加L-甲硫氨酸。KwangHoLee(KwangHoLee,JinHwanPark,TaeYongKim,etal.MolSystBiol.2007；3:149)等利用代谢工程手段，使编码天冬氨酸激酶I和III的thrA和lysC基因发生突变，解除了末端产物反馈抑制；同时失活tdh和突变ilvA基因使苏氨酸不被降解；失活metA和lysA基因，为苏氨酸合成提供了更多前体，最终通过分批发酵培养，产酸率达0.393g/g(葡萄糖，糖酸转化率为39.3％)，但发酵过程中需要添加L-蛋氨酸和L-赖氨酸，这增加了工业化生产成本。因此，人们一直渴望得到这样一种L-苏氨酸生产菌株，在其发酵过程中无需添加合成前体比如氨基酸，通过直接发酵就可以得到高产率的L-苏氨酸。
技术实现思路
为了克服现有L-苏氨酸生产技术的上述缺陷，得到理想的L-苏氨酸生产菌，本专利技术利用基因工程技术来改造大肠杆菌，通过增强与L-苏氨酸产生相关的基因，并且弱化分支代谢途径，获得一株高产L-苏氨酸的生产菌株。在其发酵过程中，不需要添加任何氨基酸，就能有效地积累L-苏氨酸，从而降低生产成本，因此具有广阔的工业化应用前景。因此，本专利技术的第一个目的在于提供一种L-苏氨酸生产菌。本专利技术的第二个目的在于提供一种L-苏氨酸生产菌的构建方法。本专利技术的第三个目的在于提供所述L-苏氨酸生产菌用于生产L-苏氨酸的应用。本专利技术的第四个目的在于提供一种生产L-苏氨酸的方法。为了达到上述目的，本专利技术对于原始大肠杆菌中与L-苏氨酸代谢途径相关的基因进行了系统的研究和筛选，并且设计出包括如下步骤的基因工程菌构建方案：A.敲除原始菌株中的在L-苏氨酸代谢途径中某些不利于L-苏氨酸合成和外运、或者促使L-苏氨酸降解的基因，获得基因敲除菌株，被敲除的基因选自tdh、tdcC和thrL中的一个或多个；B.增强步骤A中所述基因敲除菌株中的在L-苏氨酸代谢途径中某些有利于L-苏氨酸合成和外运、或者阻断L-苏氨酸降解的基因的表达，获得基因增强菌株，被增强的基因选自thrA*BC(G433R)和rhtC中的一个或多个；C.将串联表达的ppc、aspA、pntAB、thrA*(G433R)和lysC*(T342I)基因以单拷贝或多拷贝的方式插入到步骤A中所述基因敲除菌株和/或步骤B中所述基因增强菌株的基因组中，获得L-苏氨酸生产菌。通过上述基因工程构建和大量的筛选，得到一种高产L-苏氨酸的菌株，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2015556。该L-苏氨酸生产菌CCTCCM2015556是通过包括以下步骤的方法构建出来的：A.敲除作为原始菌株的大肠杆菌MG1655中的基因tdh、tdcC和thrL，获得基因敲除菌株；B.增强步骤A中所述基因敲除菌株中的基因thrA*BC(G433R)和rhtC，使这些基因过表达，获得基因增强菌株；C.构建包含过表达原始菌株中的基因ppc、aspA、pntAB、thrA*(G433R)和lysC*(T342I)的重组质粒(命名为p15K-Thr)；D.将步骤C中所述重组质粒上的基因以单拷贝或多拷贝的方式插入到步骤B中所述基因增强菌株的基因组中，获得基因工程菌CCTCCM2015556。根据本专利技术的第三个方面，提供了上述基因工程菌CCTCCM2015556在L-苏氨酸的生产中的应用。在上述应用中，通过上述基因工程生产菌的直接发酵生产L-苏氨酸，无需在培养基或发酵液中添加L-苏氨酸的合成前体比如氨基酸。在优选的实施方式中，培养基或发酵液中不添加氨基酸。根据本专利技术的优选实施例，发酵培养基组成如下：葡萄糖30g/L，NaCl0.8g/L，(NH4)2SO422g/L，K2HPO42.0g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，MnSO4·5H2O0.02g/L，FeSO4·7H2O0.02g/L，盐酸硫胺0.002g/L，酵母粉1.0g/L，CaCO330g/L，pH7.0。本专利技术所构建的L-苏氨酸生产菌在发酵过程中不需要添加任何氨基酸，就能够实现发酵过程中发酵液中L-苏氨酸的有效积累，提高了L-苏氨酸的产量及糖酸转化率，L-苏氨酸产量可高达11.27g/L，糖酸转化率达37.6％，因而具有广阔的工业应用前景。本专利技术构建的L-苏氨酸高产基因工程菌的拉丁学名是Escherichiacoli，中文名称是大肠杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2015年9月18日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015556。附图说明图1为本专利技术构建的重组质粒p15K-Thr的示意图，其过表达ppc、aspA、pntAB和thrA*(G433R)基因。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。在本文中，对于本专利技术，术语“L-苏氨酸基因工程生产菌”、“L-苏氨酸生产菌”、“基因工程菌”、“L-苏氨酸基因工程菌”、“生产L-苏氨酸的基因工程菌”、“CIBTS1792菌株”、“大肠杆菌CIBTS1792”表示相同的意义，都是指L-苏氨酸生产菌CCTCCM2015556。在本专利技术中，术语“本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种L‑苏氨酸生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015556。

【技术特征摘要】
1.一种L-苏氨酸生产菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2015556。2.一种构建如权利要求1所述L-苏氨酸生产菌的方法，其包括以下步骤：A.敲除作为原始菌株的大肠杆菌MG1655中的基因tdh、tdcC和thrL，获得基因敲除菌株；B.增强步骤A中所述基因敲除菌株中的基因thrA*BC(G433R)和rhtC，使这些基因过表达，获得基因增强菌株；C.构建包含过表达原始菌株中的基因ppc、aspA、pntAB、thrA*(G433R)和lysC*(T342I)的重组质粒；D.将步骤C中所述重组质粒上的基因以单拷贝或多拷贝的方式插入到步骤B中所述基因增强菌株的基因组中，获得基因工程菌C...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晟，蒋宇，陈飚，孙兵兵，刘映淼，
申请(专利权)人：上海工业生物技术研发中心，中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心，
类型：发明
国别省市：上海;31