本发明专利技术涉及合成包含至少一个乙内酰脲基团的肽产物的方法。所述肽产物可用作用于质量控制药物肽，具体地用于质量控制毒蜥外泌肽的参比物质。此外，本发明专利技术涉及乙内酰脲化学构件、制备所述化学构件的方法以及它们用于合成肽产物的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】合成含有乙内酰脲的肽产物 本专利技术涉及合成包含至少一个乙内酰脲基团的肽产物的方法。所述肽产物可用作 用于质量控制药物肽，具体地用于质量控制毒蜥外泌肽（exendin P印tide)的参比物质。此 外，本专利技术涉及乙内酰脲化学构件（building block)、制备所述化学构件的方法以及它们 用于合成肽产物的用途。 使用熟知的重组DNA和化学固相合成方法，已经合成了用于制药的若干蛋白和 肽。然而这些蛋白和肽的生产通常导致大量不期望的合成副产物。这在它们通过固相合成 而产生时尤其如此。随着肽/蛋白长度的增加，导致了合成步骤的增加，这些副产物可占粗 产物的50至70%。 用于肽合成的乙内酰脲化学构件的合成来自Zhang et al.，J. Org. Chem. 71 (2006), 1750-1753 ；0pacic et al. , J. Pept. Res. 66(2005), 85-93 ；Vazquez et al. , Chem. Med. Chem. 3(2008), 979-985 ；Takeuchi et al. , Chem. Commun. (2000), 785-786 ； Nefzi et al. , Bioorg. Med. Chem. Lett. 8 (1998), 2273-2278 ；Lamothe et al. , J. Comb. Chem. 4 (2002), 73-78 ;Chong and Petillo, Tetrahedron Lett. 40 (1999) ,2493-2496,以及 Park and Kurth, Tetrahedron Lett. 41(2000) ,7409-7413。 上述文件描述了乙内酰脲化合物的固相合成。然而，包含酸-不稳定的经保护的 侧链的乙内酰脲的制备是未知的。 本专利技术描述了由具有经酸-不稳定的保护基团诸如三苯甲基（Trt)、叔丁基（tBu) 或丁氧基-羰基（Boc)保护的侧链的二肽合成含有乙内酰脲的肽产物的新的合成。所得的 乙内酰脲可包含具有酸不稳定的侧链保护基团的三官能化的氨基酸，或具有完整侧链保护 基团的二官能化氨基酸和三官能化氨基酸的组合。 此外，专利技术人提供了用于制备乙内酰脲的新方法，其在酸-不稳定的载体例如 CTC(氯三苯甲基氯）树脂上进行以及例如在三光气的存在下环化。 此外，本申请提供了适于固相肽合成的新的乙内酰脲化学构件以制备具有N-末 端乙内酰脲基团的肽产物。 该方法针对肽利西拉来（AVE0010)，即一种具有44个氨基酸长度的GLP-I激动剂 进行示例性显示。利西拉来的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 1 : H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-I-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A -P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH 2 利西拉来通过化学固相合成方法产生。 在利西拉来粗产物中，发现了若干含有N-末端乙内酰脲的肽作为副产物。认为它 们通过（N-I)酰胺的氮与Fmoc (荷基甲氧基羰基（Fmoc))保护基团的羰基反应而产生，如 在图1中所示。在移去芴基甲醇后，形成了包含N-末端乙内酰脲基团的肽产物，从而导致 肽合成提早终止。如在图1显示的肽Des-乙内酰脲-(13)-AVE0010被鉴定为不能 通过色谱操作完全与AVE0010分离的产物。 专利技术人已经发现具有N-末端乙内酰脲基团的肽产物诸如Des-乙内酰 脲-(15-44)-AVE0010(也称为Des修饰的（13)-AVE0010)的靶向合成可通过固相肽 合成使用具体的乙内酰脲化学构件来进行。该化学构件通过将Fmoc-经保护的Met化学构 件偶联至氯三苯甲基氯（CTC)树脂上来合成。在Fmoc断开后，偶联另一个化学构件，即侧 链-三苯甲基（Trt)保护的Gln化学构件。在另外的Fmoc断开后，在三光气的存在进行环 化。乙内酰脲化学构件与树脂的断开在温和条件例如在20%六氟异丙醇（HFIP)在二氯甲 烷（DCM)中的溶液中进行，以将酸-不稳定的保护基团保留在Gln侧链上。反应方案显示 于图2。所得的产物⑶-2- {(S) -2, 5-二氧代-4- -咪 唑烷-1-基}-4-甲基硫基丁酸为新的化合物。该化合物可偶联至完全保护的肽产物，例 如H-(15-44)-AVE0010,其固定于适当的固体载体上。在用适当的试剂例如King's混合物 (King et al·，Int. J. Peptide Protein Res. 36 (1990) ,255-266)处理后，乙内酰脈-修饰 的肽，例如Des修饰的（13)-AVE0010可与载体断开。 该原理可用于在适当载体例如CTC树脂上制备任何乙内酰脲化学构件。保留了原 始二肽的酸不稳定保护基团。所得的乙内酰脲化学构件可偶联至肽的N-末端以在与载体 断开后得到含有乙内酰脲基团的肽。 本专利技术的方法允许以高收率和纯度靶向合成含有乙内酰脲基团的肽产物。这些肽 产物可例如用作用于质量控制药物肽产物诸如利西拉来的参比物质。 本专利技术的主题是合成式（I)的包含N-末端乙内酰脲基团的肽产物或其盐或溶剂 化物的方法： 其中 RjPR2为氨基酸侧链， P为肽残基，且 (*)在每种情况下独立地表示任选不对称的C-原子， 所述方法包括以下步骤： (a)使式（II)的乙内酰脲化学构件与式（III)的肽产物偶联， 所述式（II)为： 其中 R1，为任选经保护的氨基酸侧链， R2，为任选经保护的氨基酸侧链， Z为羧基，且 (*)在每种情况下独立地表示任选不对称的C-原子， 所述式（III)为： H2N-P ' 其中P'为任选包含经保护的氨基酸侧链的肽残基，其优选与固相载体偶联， (b)任选将保护基团与经保护的氨基酸侧链断开，以及 (C)分离并任选纯化肽产物（I)。 本专利技术的另一主题为式（I)的包含N-末端乙内酰脲基团的肽产物或其盐或溶剂 化物： 其中 RjPR2为氨基酸侧链， P为肽残基，且 (*)在每种情况下独立地表示任选不对称的C-原子。 具体地，肽产物为GLP激动剂肽产物，例如毒蜥外泌肽产物诸如毒蜥外泌 肽-4、利拉鲁肽或利西拉来（AVE0010)，或GLP-1受体激动剂如GLP-1 (7-36)、高血糖 素、胃泌酸调节素，以及结合并活化高血糖素和GLP-I受体（Hjort et al.，Journal of Biological Chemistry, 269, 30121-30124, 1994 ；Day Jff et al., Nature Chem. Biol. 5:749-757, 2009)并抑制体重增加且减少食物摄取的肽（其描述于专利申请TO 2008/071972、TO 2008/101017、TO 2009/155258、TO 2010/096052、TO 2010/096142、TO 2011/075393、TO 2008/152403、 TO 2010/070251、TO 2010/070252、TO 2010/070253、 TO 2010/070255、WO 2011/160630、WO 2011/006497、WO 201本文档来自技高网...
【技术保护点】
合成式(I)的包含N‑末端乙内酰脲基团的肽产物或其盐或溶剂化物的方法：其中R1和R2为氨基酸侧链，P为肽残基，且(*)在每种情况下独立地表示任选不对称的C‑原子，所述方法包括以下步骤：(a)使式(II)的乙内酰脲化学构件与式(III)的肽产物偶联，所述式(II)为：其中R1’为任选经保护的氨基酸侧链，R2’为任选经保护的氨基酸侧链，Z为羧基，且(*)在每种情况下独立地表示任选不对称的C‑原子，所述式(III)为：H2N‑P′其中P’为任选包含经保护的氨基酸侧链的肽残基，其优选与固相载体偶联，(b)任选将保护基团与经保护的氨基酸侧链断开，以及(c)分离并任选纯化肽产物(I)。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·亨克尔，
申请(专利权)人：赛诺菲安万特德国有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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