一种有毒微囊藻裂解噬藻体及其分离方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种有毒微囊藻裂解噬藻体及其分离方法和应用，特点是该噬藻体为MaSSC-P株，分类命名为铜绿微囊藻单链DNA噬藻体MaSSC-P，于2015年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10598，将纯化的噬藻体悬液加入微囊藻水华样品中，对水样中的微囊藻有特异性裂解作用，其对微囊藻属(Microcystis)的铜绿微囊藻，惠氏微囊藻和绿色微囊藻均有裂解作用，优点是可安全、高效、快速的裂解淡水中有毒微囊藻。

【技术实现步骤摘要】
一种有毒微囊藻裂解噬藻体及其分离方法和应用
本专利技术涉及一种有毒微囊藻裂解噬藻体，尤其是涉及一种有毒微囊藻裂解噬藻体及其分离方法和应用。
技术介绍
近年来，人类的经济活动日益加重，各种生活污水和生产废水排入湖泊、河口、海湾等缓流水体中，使水体中的氮磷等营养物质过多而变的富营养化，由此引发的藻类大量繁殖，“水华”的发生日益严重，其中蓝藻成为引起水华暴发的主要藻类。“水华”是当今世界最严重的环境灾害之一，其中我国是水华暴发最严重的国家之一，大约有75％的湖泊面临不同程度的富营养化污染，如太湖、巢湖和滇池就富营养化极为严重，经常爆发蓝藻水华，影响景观，且水华蓝藻产生大量毒素，严重降低饮用水安全性。因此对蓝藻水华的有效控制和治理具有重要的现实意义。蓝藻是一类最原始、最简单的原核生物，具有细菌的一些特征，因此又常称为蓝细菌(Cyanobacterium)，是自然水体中的主要初级生产者。蓝藻门分为两纲：色球藻纲和藻殖段纲。色球藻纲藻为单细胞；藻殖段纲藻为丝状，有藻殖段。已知的蓝藻约有2000种，蓝藻分布十分广泛，遍及世界各地，在海水和淡水中均能生长。铜绿微囊藻是一种高毒性的蓝藻，在世界范围的水华暴发中起重要作用。铜绿微囊藻对人和家畜都有很大的危害，铜绿微囊藻产生很强的藻毒素，这种藻毒素能专一性的抑制真核生物的蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性而引起肝癌。水华能引起水体溶解氧量下降，水质恶化，鱼类及其他生物的大量死亡，也在水治理中引起了很多的问题。目前，控制藻的技术主要有物理法、化学法和生物法。物理法虽控藻见效快，但是需要耗费大量的人力物力。化学法主要是通过化学药剂来控制藻类，其缺点是化学药剂在水体中会造成污染。生物控藻效果较明显，且经济环保，具有巨大的应用前景。感染蓝藻的病毒称为噬藻体。第一株噬藻体是1963年由Saferman和Mor-ris分离得到的，它能同时感染鞘丝藻(Lynbya)、席藻(Phormidi-um)和织线藻(Plectonema)，这类最早发现的噬藻体被命名为“LPP”噬藻体。噬藻体具有宿主专一性。筛选获得裂解活性高、专一感染裂解有毒水华藻的噬藻体，培养噬藻体，在蓝藻藻华形成初期和爆发期添加噬藻体，让噬藻体裂解藻华藻，是生物控藻的主要发展途径，具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可安全、高效、快速的裂解淡水中有毒微囊藻的有毒微囊藻裂解型噬藻体及其分离方法和应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种有毒微囊藻裂解噬藻体，命名为铜绿微囊藻单链DNA噬藻体(Microcysticaeruginosasingle-strandDNAcyanophage)MaSSC-P株，于2015年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10598。该噬藻体的生物学特征如下：MaSSC-P噬藻体具有呈正多面体的头部结构和细长的尾部，头部直径85nm，尾部长250nm；噬藻体在藻平板上可以形成大小形状均一的噬藻斑，周围无晕环，边缘清晰规则；该噬藻体能被DnaseI、S1单链核酸酶消化，而不能被RnaseA酶消化处理。该噬藻体的生物学特征如下：该噬藻体在40~50℃中放置1h，仍保持感染活性；在超过60℃条件下则失活；噬藻体在pH3.0~11.0环境下，保持感染活性；噬藻体耐紫外，对氯仿敏感，可储存于4℃或-80℃温度下。上述有毒微囊藻裂解噬藻体的分离纯化方法，具体包括如下步骤：（1）噬藻体的分离将采集的含有毒微囊藻裂解噬藻体的水域表层水样依次经中速滤纸、0.45μm和0.22μm硝酸纤维素滤膜过滤；将滤液与处于对数生长期的铜绿微囊藻按体积比1:4的比例感染混合，于光照强度为2000lx，温度为25℃，光暗周期为12h∶12h条件下培养，将发生黄化的培养液进行连续传代感染直至保持稳定噬藻性，得到噬藻体感染液；（2）噬藻体的扩增培养和纯化将噬藻体感染液与铜绿微囊藻液按体积比1：9的比例混合后，于摇床上室温培养30min，然后倒入冷却至42℃的含质量体积分数0.7%琼脂的BG-11培养基中，充分混匀后倒入底层含质量体积分数1.5%琼脂的BG-11培养基平板的培养皿中，待其凝固，倒置置于2000lx，25℃，光照周期：12h/12h的培养箱中培养，培养5~7天后，刮取所形成的噬藻斑；（3）噬藻体进一步纯化将上述步骤（2）得到的噬藻斑悬浮于BG-11培养基中，涡旋4℃过夜后，离心取上清后，重复上述步骤（2）噬藻斑实验2次，得到形状、大小均一的噬藻斑，然后将噬藻斑悬浮于BG-11培养基中，用0.22μm滤膜离心过滤后，取滤液，在滤液中加入PEG8000至其质量体积终浓度为9%，4℃沉降过夜，在4℃下36,000×g离心2h，用BG-11培养基洗涤沉淀，得到纯化的噬藻体悬浮液。将纯化的噬藻体悬浮液加入微囊藻水华样品中，对水样中的微囊藻有特异性裂解作用。其对微囊藻属(Microcystis)的铜绿微囊藻M.aeruginosaFACHB-924、M.aeruginosaFACHB-925，惠氏微囊藻M.wesenbergiiFACHB-908、M.wesenbergiiFACHB-929，绿色微囊藻M.viridisFACHB-979均有裂解作用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种有毒微囊藻裂解噬藻体及其分离方法和应用，其首次公开了铜绿微囊藻单链DNA噬藻体，该裂解性噬藻体感染蓝藻后，可以在宿主内快速增殖，并使之裂解。微囊藻裂解性噬藻体可以特异性感染并裂解微囊藻属，因而在水华治理中，微囊藻裂解性噬藻体能够作为“控藻因子”来控制微囊藻引起的水体水华，并且是从自然水域中分离所得。该裂解型噬藻体可安全、高效、快速的裂解淡水中有毒微囊藻，使指数生长的微囊藻（106~107个/ml）裂解死亡降至103~104个/ml。对微囊藻宿主特异性较强，对环境和人类不会产生危害；同时培养条件简单，易扩大培养，可作为一种潜在的新型治理蓝藻水华的“控藻产品”和手段。有毒微囊藻裂解噬藻体，命名为铜绿微囊藻单链DNA噬藻体(Microcysticaeruginosasingle-strandDNAcyanophage)MaSSC-P株，于2015年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10598，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。附图说明图1为MaSSC-P噬藻体的电镜图；图2MaSSC-P核酸经DnaseI酶、RnaseA酶和S1单链核酸酶处理后琼脂糖凝胶电泳图（泳道1：未处理的核酸，泳道2：DnaseI酶处理，泳道3：RnaseA酶处理，泳道4：S1单链酶处理）；图3为温度、紫外线、氯仿以及pH对MaSSC-P噬藻体稳定性的影响；图4为噬藻体的溶藻情况和一步生长曲线。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1噬藻体MaSSC-P的制备水样采自浙江省宁波市宁波帮文化公园；宿主藻为铜绿微囊藻M.aeruginosaFACHB-925，具体制备方法如下：（1）噬藻体的分离将采集的含有毒微囊藻裂解噬藻体的水域表层水样依次经中速滤纸、0.45μm和0.22μm硝酸纤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有毒微囊藻裂解噬藻体，其特征在于：该噬藻体命名为铜绿微囊藻单链DNA噬藻体MaSSC‑P株，于2015 年5 月25 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10598。

【技术特征摘要】
1.一种有毒微囊藻裂解噬藻体，其特征在于：该噬藻体命名为铜绿微囊藻单链DNA噬藻体MaSSC-P株，于2015年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10598。2.根据权利要求1所述的一种有毒微囊藻裂解噬藻体，其特征在于该噬藻体的生物学特征如下：MaSSC-P噬藻体具有呈正多面体的头部结构和细长的尾部，头部直径85nm，尾部长250nm；噬藻体在藻平板上形成大小形状均一的噬藻斑，周围无晕环，边缘清晰规则；该噬藻体能被DnaseI、单链核酸酶消化，而不能被RnaseA酶消化处理。3.根据权利要求1所述的一种有毒微囊藻裂解噬...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘飞，李登峰，严小军，刘联国，吴寒华，顾叶华，陈梅娟，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33