一种L-鸟氨酸的分离纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种L-鸟氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)离子交换；(2)纳滤；(3)调pH、脱色；(4)反渗透浓缩；(5)浓缩结晶。本发明专利技术采用膜分离、纳滤脱色、膜浓缩等先进处理工艺节省了能耗，节省了活性炭的用量，减少了对环境的污染，降低了生产成本，提高了产品质量。

【技术实现步骤摘要】
一种L-鸟氨酸的分离纯化方法
本专利技术涉及一种L-鸟氨酸的分离纯化方法，属于生物

技术介绍
鸟氨酸是1877年，杰弗在喂养安息香酸的鸟类尿液的水解产物中发现的，因此得名。它是细菌细胞膜和多肽类抗生素的组成成分，可以作为氨基酸输液原料。能促进生长激素的分泌，以协助机体代谢过多的脂肪，与精氨酸配合使用具有很好的减肥效果。在动物体内主要参与尿酸循环，对于体内氨态氮的排出有重要作用。鸟氨酸是维持免疫系统和肝功正常不可缺少的，能解毒氨及帮助肝再生，除在医药上作为试剂与注射液外，还通常与精氨酸一起用作保肝、强身、解毒剂之类药剂的原料。在皮肤和结缔组织中含有高浓度的鸟氨酸对于愈合和修复损伤组织非常有益。鸟氨酸是由体内的精氨酸合成的，反过来，它又是瓜氨酸、脯氨酸和谷氨酸的前体。鸟氨酸能将氨转化为尿素与谷氨酰氨，因此补充鸟氨酸可为解毒途径提供酶的作用物。当身体制造尿素，精氨酸便会被新陈代谢掉，身体转为制造鸟氨酸。用动物做的实验证明鸟氨酸和精氨酸能令身体生产更多合成代谢的、促进生长的荷尔蒙，包括胰岛素和生长荷尔蒙，来促进肌肉生长。此外，鸟氨酸还用于配制恢复疲劳的发泡饮料。在生物体内，鸟氨酸能在尿素循环(Krebs.Henseleit循环)中起作用。尿素循环分为4步，能够将生物体内天冬氨酸以及氨中的氮元素转化为尿素，因而是生物体内的主要排氨方式。动物利用新陈代谢将体内多余的氮元素转化为尿素的主要器官是肝脏，体内的精氨酸在精氨酸酶的催化作用下水解，产生尿素和鸟氨酸。精氨酸水解后产生的鸟氨酸，将会与氨甲酰磷酸反应，进而产生瓜氨酸，瓜氨酸会进一步与天冬氨酸反应而生成精氨基琥珀酸，精氨基琥珀酸最终会在酶的催化作用下进一步被分解为延胡索酸以及精氨酸等产物。由于该反应的第一步是将精氨酸转化为尿素，反应到最后又生成了精氨酸，周而复始，所以该反应称为尿素循环。由于目前全世界氨基酸产业的迅速发展，各地的科学家逐渐认识到了L-鸟氨酸的多种生物功能，其中日本最为突出，他们在20世纪40年代就开始对L-鸟氨酸有所研究，在10-20年后就有许多文章发表，且多数是以专利的形式发表的。其中包括鸟氨酸生产菌株、鸟氨酸高产菌株的选育、鸟氨酸的定量分析以及发酵法生产-鸟氨酸的发酵条件优化等，并且以专利文献的形式发表。但是此期间在国内却很少听到对于-鸟氨酸的研究。直至1998年至2000年间，才报道有张克旭、潘韵和陈宁等人曾做过关于L-鸟氨酸的菌种筛选和发酵方面的研究，有几篇论文发表。与国外的研究相比，我国L-鸟氨酸产业还处于起步阶段，所研究的面很窄，而且研究进展较慢，目前仅发展到摇瓶试验阶段，要进行工业化生产还需要我们进行大量的试验和研究。和国外相比，我国对鸟氨酸的研究有很大的差距，研究面窄，进展不大，仅限于摇瓶试验，离工业化生产还有很长的路要走。鸟氨酸是精氨酸的衍生物，在医药、保健、食品和化工等领域具有广泛用途，市场需求逐年增长，国内外尚无大规模生产的报道。鸟氨酸生产方法主要有化学法、微生物发酵法和酶转化法。化学法工艺繁杂，环境污染严重，副产物多且不易分离；微生物发酵法由于缺乏性能优良的生产菌株和生产工艺的系统研究，限制了该方法的发展和应用。酶转化法是精氨酸在精氨酸酶的专一作用下生成鸟氨酸，产品纯度高，是最具开发潜力的鸟氨酸生产方法，优质廉价的精氨酸原料和转化酶的获得是该方法的关键。鸟氨酸的生产方法有4种：发酵法：酶法；化学合成法和蛋白质水解提取法。(1)发酵法发酵法是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对菌株的质诱变等处理，选育出各种营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量合成某种氨基酸的目的。发酵法包括直接发酵法和添加前体发酵法。氨基酸产生菌是实现发酵法生产氨基酸的前提，在氨基酸发酵的建立和改进中起着非常重要的作用。根据氨基酸产生菌的遗传性状，可将其分为四类：第一类为直接使用野生型菌株由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸；第二类为营养缺陷型变异株；第三类为氨基酸结构类似物抗性变异株；第四类为营养缺陷型(或渗漏型)兼结构类似物抗件变异株。应用发酵法生产鸟氨酸因产酸水平较低实用价值不大。发酵法主要是利用精氨酸(Arg-)或瓜氨酸(Cit-)的营养缺陷型突变株来积累鸟氨酸。Takayasu等在营养缺陷型菌株的基础上筛选到具有霉酚酸抗性的突变株，最高产量可达50g/L；李环等利用混合菌种发酵生产鸟氨酸，产量达40g/L左右。发酵法原料成本低廉，但是发酵液中成分复杂，后续分离困难。(2)化学合成法化学法制备鸟氨酸根据化学反应机理可分为有机合成法和精氨酸水解法两种。该法采用基础化工原料合成鸟氨酸，原料来源广泛且成本低。然而该法经过多步化学反应合成，收率偏低；其原料中的氰化氢为剧毒致癌物，在工业生产中应尽量避免使用。化学法合成出的鸟氨酸为DL型混合物，产物的手性拆分亦给该工艺增加了难度和成本，这些方面都成为该法的主要缺陷所在。化学法是利用弱碱水解精氨酸得到鸟氨酸和少量瓜氨酸。化学法生产鸟氨酸产物为DL-型外消旋体，分离困难，生产过程不易控制，现已被淘汰。(3)蛋白质水解提取法以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种氨基酸的方法称为水解法。随着氨基酸生产技术的进步。由蛋白质水解法提取氨基酸这一古老的生产方法受到很大的冲击，传统的水解法生产谷氨酸已失去其存在的价值。(4)酶法酶法生产鸟氨酸就是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸，生成鸟氨酸和尿素；酶法生产氨基酸具有工艺简单、周期短、耗能低、专一性强、收率高等特点。L-精氨酸酶广泛存在于动物的肝脏、植物、酵母和细菌中传统的酶法制备鸟氨酸方法，采用以牛肝为酶源，从牛肝中提取L-精氨酸酶，以成品精氨酸为合成底物转化鸟氨酸。酶法生产鸟氨酸专一性强，反应条件温和，避免采用氰化氢等有毒化学品，同时底物转化率高，产品较纯，有利于后续分离，但是精氨酸酶的来源不易，底物精氨酸的成本也较高。如何获得廉价的合成底物和酶源是这一方法能否成功应用的关键。本技术采用发酵法生产的精氨酸纯化液为原料，采用假单胞菌产生的精氨酸酶转化生产鸟氨酸，原料易得，酶成本低廉，结合固定化酶技术，可节约鸟氨酸生产成本，制造出高质量的产品。申请人多年来致力于发酵法生产精氨酸及其衍生物关键技术的研究，拥有年产500吨的精氨酸生产线。鉴于国内外市场需求强劲的现状，申请人对鸟氨酸高效生物制造技术及产业化进行研究，创造性的提出了微生物酶法生产鸟氨。依托现有精氨酸技术和原料优势，选育了生产鸟氨酸的精氨酸酶的高效菌株，以精氨酸为原料通过酶转化获得鸟氨酸。本专利技术产品纯度高易分离，同时克服了原料和酶昂贵不易获取的劣势，具有规模化生产的前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株产精氨酸酶的菌株MQO-154，本专利技术经过对苏云金芽孢杆菌(土壤分离)进行紫外诱变和化学诱变，筛选到一株精氨酸酶活性较高的菌株，经分离纯化后获得菌株MQO-154，其保藏编号为：CGMCCNo.10728；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2015年4月21日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。菌株MQO-154的生物特性为：该菌株在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种L‑鸟氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)离子交换：将L‑鸟氨酸转化液经氨型732树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用1.0N氨水洗脱，洗脱液再过流D335‑OH型树脂除去阴离子杂质得到L‑鸟氨酸纯化液；(2)纳滤：采用800分子量纳滤膜过滤L‑鸟氨酸纯化液得到L‑鸟氨酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后，弃去浓缩液，收集含L‑鸟氨酸产品的纳滤透析液；(3)调pH、脱色：用盐酸调节鸟氨酸纳滤清液的pH至4.5，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为鸟氨酸纳滤清液的0.5％(质量分数)，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液；(4)反渗透浓缩：将L‑鸟氨酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到L‑鸟氨酸脱氨后的预浓缩液；(5)浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至浓缩度含量≥80％的浓缩液，将浓缩液放至5℃冰箱保温2h得到L‑鸟氨酸结晶。

【技术特征摘要】
1.一种L-鸟氨酸的分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)离子交换：将L-鸟氨酸转化液经氨型732树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用1.0N氨水洗脱，洗脱液再过流D335-OH型树脂除去阴离子杂质得到L-鸟氨酸纯化液；(2)纳滤：采用800分子量纳滤膜过滤L-鸟氨酸纯化液得到L-鸟氨酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后，弃去浓缩液，收集含L-鸟氨酸产品的纳滤透析液；(3)调pH、脱色：用盐酸调节鸟氨酸纳滤清液的pH至4.5，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为鸟氨酸纳滤清液的0.5％(质量分数)，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液；(4)反渗透浓缩：将L-鸟氨酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到L-鸟氨酸脱氨后的预浓缩液；(5)浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至浓缩度含量≥80％的浓缩液，将浓缩液放至5℃冰箱保温2h得到L-鸟氨酸结晶；离子交换步骤中L-鸟氨酸转化液的方法，包括以下步骤：①底物的获得：将精氨酸陶瓷膜过滤液经711氨型树脂吸附，用2.0N氨水洗脱，得到精氨酸阳柱纯化液；②转化培养：向精氨酸纯化液中加入精氨酸酶发酵培养液进行转化，精氨酸的浓度为50g/L，精氨酸酶用量为4mL/L，温度为30℃，pH为9.5，反应时间为20h，即得；转化培养步骤中所述精氨酸酶的制备方法如下：a、斜面培养：将菌株MQO-154在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养温度为35℃，培养时间为24h；b、种子扩大培养：从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后的浓度为3×105-5×105个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，扩大培养的温度为30℃，培养时间为24h；0-10h，摇床转速100r/min，10-20h，摇床转速120r/min，20-24h，摇床转速100r/min；c、发酵培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：高法民，高树营，李令娣，
申请(专利权)人：山东民强生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37