表达限制的免疫球蛋白轻链库的小鼠制造技术

本发明专利技术提供遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠表达由有限数量的轻链可变结构域表征的免疫球蛋白轻链库。提供小鼠，其呈现2种人轻链可变的基因段的选择，使得由小鼠表达的免疫球蛋白轻链包含2种人轻链可变的基因段之一。提供使用本文所述的小鼠制造具有通用轻链的双特异性抗体的方法，包括人轻链可变区。提供制造适合用于多特异性结合蛋白，例如，双特异性抗体的人可变区的方法，及宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达限制的免疫球蛋白轻链库的小鼠【相关申请的交叉引用】本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年3月13日提交的美国专利申请系列No.13/798,455的权利，该申请通过引用以其整体在此合并。【序列表】本申请参考以电子形式作为ascii.txt文件于2014年3月13日提交的命名为“2010794-0550_ST25”的序列表。该.txt文件在2014年3月11日产生及具有33kb尺寸。
提供遗传修饰的小鼠，其表达具有与多样的人可变/小鼠恒定重链结合的常见人可变/小鼠恒定轻链的抗体。提供自小鼠的B细胞的人可变区基因序列制造人双特异性抗体的方法。
技术介绍
抗体一般包含同源二聚体重链组分，其中各重链单体与同一轻链结合。期望具有异源二聚体重链组分的抗体(例如,双特异性抗体)作为治疗性抗体。但制造具有可令人满意地与双特异性抗体的各重链结合的适合的轻链组分的双特异性抗体遇到了问题。在一方法中，轻链可通过观测全部轻链可变结构域的利用统计学，鉴定在人抗体中最常采用的轻链，及轻链与不同特异性的2个重链体外配对来选择。在另一方法中，轻链可通过观察噬菌体展示库(例如,包含人轻链可变区序列的噬菌体展示库,例如,人scFv库)中的轻链序列及自所述库选择最通常使用的轻链可变区来选择。然后可在2种不同重目标链上测试轻链。在另一方法中，轻链可通过使用目标重链的重链可变序列作为探针检定轻链可变序列的噬菌体展示库来选择。与两个重链可变序列结合的轻链可选择为用于所述重链的轻链。在另一方法中，候选轻链可与重链的同源轻链比对，及在轻链中制造修饰，以更紧密匹配对于两个重链的同源轻链共同的序列特征。如果需要最小化免疫原性机会，修饰优选产生存在于已知道的人轻链序列的序列，使得蛋白水解处理不可能基于本领域知道的评定免疫原性的似然性的参数和方法(即,电子以及湿测定)产生T细胞表位。全部以上方法依赖于包含许多先验遏制，例如，序列同一性，与特定预选择的重链结合的能力，等的体外方法。本领域需求不依赖于操作体外条件，而代之以采用更以生物学方式能感觉的方法制造包括常见轻链的人表位-结合蛋白的组合物和方法。【专利技术概述】提供表达人免疫球蛋白重和轻链可变结构域的遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠具有限制的轻链可变的库。提供产生与多样的亲和性-成熟的人重链可变结构域库结合及随多样的亲和性-成熟的人重链可变结构域库表达的人轻链可变结构域的生物学系统。提供制造包含免疫球蛋白可变结构域的结合蛋白的方法，包括用目标抗原免疫具有限制的免疫球蛋白轻链库的小鼠，及在特异性结合目标抗原的结合蛋白中采用小鼠的免疫球蛋白可变区基因序列。方法包括制造适合于在制造多-特异性抗原-结合蛋白中使用的人免疫球蛋白重链可变结构域的方法。提供遗传加工的小鼠，其选择源于未重排的人重链可变区基因段的库的适合的亲和性-成熟的人免疫球蛋白重链可变结构域，其中所述亲和性-成熟的人重链可变结构域与源于1种人轻链可变区基因段的单人轻链可变结构域结合及随源于1种人轻链可变区基因段的单人轻链可变结构域表达。也提供呈现2种人轻链可变区基因段的选择的遗传加工的小鼠。在多方面，1或2个基因段包括人Vκ1-39和/或人Vκ3-20。提供遗传加工的小鼠，其自人轻链可变区基因段的限制的库表达人轻链可变结构域，或单人轻链可变结构域的限制的库。在一些实施方式中，提供的小鼠被遗传加工而包括单未重排的人轻链可变区基因段(或2个人轻链可变区基因段)，其重排而形成重排的人轻链可变区基因(或2个重排的轻链可变区基因)，所述基因表达单轻链(或表达2个轻链之任一个或二者)。重排的人轻链可变结构域能与由小鼠选择的多个亲和性-成熟的人重链配对，其中所述重链可变区特异性结合不同表位。提供遗传加工的小鼠，其自人轻链可变区序列的限制的库表达人轻链可变结构域，或单人轻链可变结构域的限制的库。在一些实施方式中，提供的小鼠被遗传加工而包括表达单轻链(或表达2个可变区之任一或二者)的可变区的单V/J人轻链序列(或2V/J序列)。轻链包含能与由小鼠克隆选择的多个亲和性-成熟的人重链配对的可变序列，其中所述重链可变区特异性结合不同表位。一方面，提供遗传修饰的小鼠，其包含能与人J基因段(选自1个或多个JL段)重排及编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域的单人免疫球蛋白轻链可变(VL)区基因段。在另一方面，提供遗传修饰的小鼠，其包含不多于2个人VL基因段，各能与人J基因段重排(选自1个或多个JL段)及编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域。在一些实施方式中，2个人VL基因段在小鼠的基因组中并置。在一些实施方式中，2个人VL基因段处于小鼠基因组中的不同座位(例如,杂合子,在第1轻链等位基因包含第1人VL段,及在第2轻链等位基因包含第2个人VL段,其中所述第1和第2个人VL段不同)。在一些实施方式中，2个人VL基因段是人Vκ1-39基因段和人Vκ3-20基因段。在一实施方式中，人JL基因段选自：Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4，Jκ5和其配对组合。在各种实施方式中，提供的遗传加工的小鼠不能表达含有内源性VL基因段的免疫球蛋白轻链。例如，在一些实施方式中，提供的遗传加工的小鼠含有灭活和/或去除内源性VL基因段的部分或全部的遗传修饰。在一实施方式中，单人VL基因段可操作地连接于选自下列的人JL基因段：Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4和Jκ5，其中所述单人VL基因段能重排而形成编码具有1个或更多人JL基因段之任何的轻链可变区基因的序列。在一实施方式中，提供的遗传修饰的小鼠包含不包含内源性小鼠VL基因段的免疫球蛋白轻链座位，其能重排而形成免疫球蛋白轻链基因，其中所述VL座位含有能重排而编码轻链基因的VL区的单人VL基因段。在特定实施方式中，人VL基因段是人Vκ1-39Jκ5基因段或人Vκ3-20Jκ1基因段。在一些实施方式中，提供的遗传修饰的小鼠包含不包含内源性小鼠VL基因段的VL座位，其能重排而形成免疫球蛋白轻链基因，其中所述VL座位包含不多于2个能重排而编码轻链基因的VL区的人VL基因段。在一些特定实施方式中，不多于2个人VL基因段选自：人Vκ1-39基因段，人Vκ3-20基因段，及其组合。在一些特定实施方式中，不多于2个人VL基因段是人Vκ1-39Jκ5基因段和人Vκ3-20Jκ1基因段。一方面，提供遗传修饰的小鼠，其包含编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域的单重排的(V/J)人免疫球蛋白轻链可变(VL)区(即,VL/JL区)。在另一方面，小鼠包含不多于2个能编码人免疫球蛋白轻链的VL结构域的重排的人VL区。在一实施方式中，VL区是重排的人Vκ1-39/J序列或重排的人Vκ3-20/J序列。在一实施方式中，人重排的VL/JL序列的JL段选自Jκ1，Jκ2，Jκ3，Jκ4和Jκ5。在特定实施方式中，VL区是人Vκ1-39Jκ5序列或人Vκ3-20Jκ1序列。在特定实施方式中，小鼠具有人Vκ1-39Jκ5序列和人Vκ3-20Jκ1序列。在一实施方式中，人VL基因段可操作地连接于人或小鼠前导序列。在一实施方式中，前导序列是小鼠前导序列。在特定实施方式中，小鼠前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。在特定实施方式中，前导序列可操作地连接于未重排的人VL基因段。在特定实施方式中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
小鼠，其包含：与小鼠或大鼠轻链恒定区可操作地连接的不多于2个人VL基因段和2个或更多人JL基因段；以及与非‑人恒定区可操作地连接的1个或更多人VH、1个或更多人DH及1个或更多人JH基因段；其中所述人基因段能重排及编码抗体的人可变结构域，且其中所述小鼠不包含内源性VL基因段，其能重排而形成免疫球蛋白轻链。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.13 US 13/798,4551.制造小鼠的方法，其包括在所述小鼠的种系基因组内插入：2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段和5个未重排的人免疫球蛋白Jκ基因段，其可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，其中所述2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段是人Vκ1-39和人Vκ3-20，及所述5个未重排的人免疫球蛋白Jκ基因段是：人Jκ1、人Jκ2、人Jκ3、人Jκ4和人Jκ5；以及1个或更多未重排的人免疫球蛋白VH基因段，1个或更多未重排的人免疫球蛋白DH基因段，及1个或更多未重排的人免疫球蛋白JH基因段，其可操作地连接于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列；其中所述未重排的人免疫球蛋白Vκ和Jκ基因段能重排及编码抗体的人免疫球蛋白轻链可变结构域，且所述未重排的人免疫球蛋白VH、DH和JH基因段能重排及编码抗体的人免疫球蛋白重链可变结构域，且其中所述小鼠不包含能重排而形成免疫球蛋白轻链可变区的内源性免疫球蛋白Vκ基因段。2.权利要求1的方法，其中所述2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段和所述5个人免疫球蛋白Jκ基因段可操作地连接于小鼠免疫球蛋白轻链恒定区序列。3.权利要求2的方法，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区序列是小鼠Cκ区。4.权利要求1的方法，其中所述2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段和5个未重排的人免疫球蛋白Jκ基因段存在于内源性小鼠免疫球蛋白κ轻链座位。5.权利要求1的方法，其中所述小鼠包含功能性λ轻链座位。6.权利要求1的方法，其中所述小鼠包含无功能性λ轻链座位。7.权利要求4的方法，其中与小鼠免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接的2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段和5个未重排的人免疫球蛋白Jκ基因段存在于内源性小鼠免疫球蛋白κ轻链座位，所述座位以5’→3’顺序包含：人Vκ1-39、人Vκ3-20、人Jκ1、人Jκ2、人Jκ3、人Jκ4和人Jκ5。8.小鼠的分离的细胞，所述小鼠在种系基因组内有：2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段和5个未重排的人免疫球蛋白Jκ基因段，其可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，其中所述2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段是人Vκ1-39和人Vκ3-20，及所述5个未重排的人免疫球蛋白Jκ基因段是：人Jκ1、人Jκ2、人Jκ3、人Jκ4和人Jκ5；以及1个或更多未重排的人免疫球蛋白VH基因段，1个或更多未重排的人免疫球蛋白DH基因段，及1个或更多未重排的人免疫球蛋白JH基因段，其可操作地连接于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列；其中所述未重排的人免疫球蛋白Vκ和Jκ基因段能重排及编码抗体的人免疫球蛋白轻链可变结构域，且所述未重排的人免疫球蛋白VH、DH和JH基因段能重排及编码抗体的人免疫球蛋白重链可变结构域，且其中所述小鼠不包含能重排而形成免疫球蛋白轻链可变区的内源性免疫球蛋白Vκ基因段。9.权利要求8的小鼠的分离的细胞，其中所述分离的细胞是B细胞。10.杂交瘤，其用权利要求9中提及的B细胞制造。11.制造小鼠胚胎干(ES)细胞的方法，其包括从根据权利要求1～7之任一项的方法制造的小鼠分离胚胎干细胞的步骤。12.小鼠用于产生抗体的用途，所述小鼠在种系基因组内有：2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段和5个未重排的人免疫球蛋白Jκ基因段，其可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区序列，其中所述2个未重排的人免疫球蛋白Vκ基因段是人Vκ1-39和人Vκ3-20，及所述5个未重排的人免疫球蛋白Jκ基因段是：人Jκ...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·巴布，J·麦克维尔特，L·麦克唐纳，S·史蒂文斯，S·戴维斯，D·R·巴克勒，K·A·米盖尔，A·J·墨菲，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US