一种内源性的非编码小RNA miR-873的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种内源性的非编码小RNA miR-873的应用。尤其是miR-873在用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受的药物上的应用。此外，还可以用于制备调控A20基因的制剂，以及用于制备吗啡耐受条件下脊髓释放的促炎因子TNFα的调控制剂。本发明专利技术证实miR-873通过调控TNFα诱导蛋白-3(A20)参与吗啡耐受形成，为miR-873在治疗或缓解慢性疼痛及吗啡耐受药物上的应用打下重要基础。

【技术实现步骤摘要】
一种内源性的非编码小RNAmiR-873的应用
本专利技术属于生物医药
本专利技术涉及一种内源性的非编码小RNA的用途，具体涉及一种miR-873在制备用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受的药物上的应用。
技术介绍
吗啡作为一种经典的阿片类镇痛药物，广泛应用于临床急慢性疼痛治疗中。但是吗啡长期使用导致的吗啡耐受(Morphinetolerance,MT)是限制其临床应用的一大医学难题。由于吗啡耐受的机制尚不完全清楚，且缺乏有效的防治措施，因此吗啡耐受一直是慢性疼痛研究领域的热点。MicroRNA(miRNA,miR)是一类长度约为21-23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体(pre-miRNA)加工而来，能够和互补或部分互补的靶mRNA的3＇末端非翻译区(3'-UTR)结合，诱导靶mRNA降解或介导其翻译抑制，从而在转录后发挥调控靶基因的功能。既往对基因表达和功能改变的研究主要集中于转录水平以及基因产物的翻译后修饰调节，对靶基因mRNA翻译过程的调控研究甚少。miR通过抑制靶基因mRNA翻译或促进mRNA从翻译复合体中分离降解，快速持久降低靶蛋白水平，从而参与多种病理生理过程。近年研究表明，miRNA不仅与人类遗传性疾病及神经系统发育和一些重大疾病的发生发展密切相关，而且在慢性疼痛研究领域中也发挥重要作用。我们采用miRNA芯片技术发现吗啡耐受大鼠脊髓背角miR-873分子表达水平显著上调，且这些miRNAs的靶基因中有吗啡耐受相关基因，miRNA调控基因表达是通过机体内源性调控通路，具有更高的稳定性和组织相容性，更低的毒副作用，可能成为新的治疗策略。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种内源性的非编码小RNAmiR-873的应用，制备用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受的药物,所述的非编码小RNAmiR-873的序列为：GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU。上述用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受的药物包括：慢病毒介导的miR-873干扰载体。根据miR-873序列，利用shRNA设计程序，按照RNA干扰序列设计原则，设计干扰靶点序列；将载体进行酶切，使其线性化，通过T4DNA连接酶与双链干扰靶点序列进行连接反应形成shRNA表达载体，将连接好的产物转入制备好的感受态大肠杆菌，对长出的克隆进行酶切鉴定，挑选阳性克隆测序，进行测序比对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的shmiR-873干扰慢病毒载体；然后对构建成功的shmiR-873干扰载体进行慢病毒包装。具体是根据miR-873序列，利用shRNA设计程序，按照RNA干扰序列设计原则，设计干扰靶点序列5’-AUAAGGAUUUUUAGGGCAUUA-3’；将pLenR-GPH载体两端分别以EcoRⅠ、BamHⅠ为酶切位点进行酶切，使其线性化，通过T4DNA连接酶与双链干扰靶点序列进行连接反应形成shRNA表达载体，将连接好的产物转入制备好的感受态大肠杆菌，对长出的克隆进行酶切鉴定，挑选阳性克隆测序，进行测序比对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的shmiR-873干扰载体；对构建成功的shmiR-873干扰载体进行慢病毒包装，制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，所需的载体包括：pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G以及所述的构建成功的shmiR-873干扰载体，其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE慢病毒转移质粒能表达绿色荧光蛋白GFP，pMD2G含有病毒包装所必需的元件；4种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染HEK293T细胞；HEK293T细胞常规培养于含100mL/LFBS的DMEM培养基；转染前1d，取对数期状态的细胞，用胰蛋白酶消化后调整细胞密度为0.5×109个/L时，重新接种于体积25mL的直径15cm细胞培养皿，37℃，50mL/LCO2培养箱内培养；当细胞密度达培养皿60％～70％时，将10ug干扰载体，10.5ugpMDlg-pRRE，10.5ugpMD2G，9ugpRsv-REV加入293.3ulpH8.8的0.1×TEbuffer中，再加入155.6ul双蒸水，随后加入50.2ul2.5M的CaCl2混匀，随即加入500ul2×HBS，边滴加边搅拌至少2min，室温静置10min，将混合物分散逐滴加入每个孔中；将培养皿放入培养箱中37℃，3％CO2培养；转染后12h更换为完全培养液继续培养，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，于4℃，4000r/min离心10min，去除细胞碎片，以0.45μm滤器过滤，置于40mL超速离心管中，4℃，25000r/min离心20min后去上清液，以冷的PBS液分别溶于500μLDMEM和500μLPBS重悬病毒沉淀于4℃溶解过夜。本专利技术研究表明miR-873通过调控靶基因A20参与吗啡耐受的发生和维持。靶基因A20通过负向调节胶质细胞在吗啡耐受条件下脊髓释放的促炎因子TNFα参与炎症形成。本专利技术的第二个目的是提供一种内源性的非编码小RNAMiR-873的第二种应用，miR-873用于调控A20基因(GeneID:7128)。本专利技术的第三个目的是提供一种内源性的非编码小RNAsMiR-873的第三种应用，miR-873用于制备调控A20基因的制剂。本专利技术的第四个目的是提供一种内源性的非编码小RNAsMiR-873的第四种应用，miR-873用于调控胶质细胞在吗啡耐受条件下脊髓释放的促炎因子TNFα，从而参与炎症形成。本专利技术的第五个目的是提供一种内源性的非编码小RNAsMiR-873的第五种应用，miR-873用于制备吗啡耐受条件下脊髓释放的促炎因子TNFα的调控制剂。本专利技术证实miR-873通过调控TNFα诱导蛋白-3(A20)参与吗啡耐受形成。TNFα诱导蛋白-3(A20)又称作A20,由TNFα,IL-1,LPS等多种细胞因子通过激活NFκB,启动A20基因转录而表达。A20通过其N端的去泛素化可以抑制NFκB通路中接头蛋白如RIP1,TRAF6,NEMO等的功能,并通过其C端的泛素化活性促进RIP1的泛素化降解,从而抑制IKK的活性,之后抑制NFκB的激活。A20在对炎症免疫系统的调控中发挥重要作用,其基因存在很多单核苷酸多态性(SNP)位点,这些SNP与许多自身免疫性疾病如类风湿性关节炎,系统性红斑狼疮,银屑病,克隆氏病等密切相关。我们研究发现吗啡耐受大鼠脊髓背角miR-873明显上调，通过生物信息学软件预测及文献分析，我们预测A20基因是miR-873调控的靶基因之一。TNF-α是胶质细胞在吗啡耐受条件下脊髓释放的促炎因子。A20可负向调节促炎因子TNFα参与炎症形成，因此抑制miR-873的表达可以负向调节TNFα，从而通过调节炎症反应治疗或缓解慢性疼痛或吗啡耐受。因此，本专利技术提供了miR-873在用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受的药物上的应用。此外，还可以用于制备调控A20基因的制剂，以及用于制备吗啡耐受条件下脊髓释放的促炎因子TNFα的调控制剂，意义重大。附图说明图1：吗啡耐受组(NS组)和生理盐水对照组(Sham组)包括miR-873在内的脊髓背角差异表达miRNAR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种内源性的非编码小RNA miR‑873的应用，其特征在于，制备用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受的药物，所述的非编码小RNA miR‑873的序列为：GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU。

【技术特征摘要】
1.一种内源性的非编码小RNAmiR-873在制备用于治疗或者缓解慢性疼痛及吗啡耐受药物中的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹望远，王健，郭曲练，宋宗斌，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43