本发明专利技术涉及一种利用菌株MQO-153制备精氨酸脱亚胺酶的方法，所述方法包括以下步骤：(1)斜面培养：将菌株MQO-153在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养；(2)扩大培养：从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后的浓度为3×105-5×105个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养；(3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中培养；(4)30L发酵罐培养：将步骤(3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的培养基中发酵后得精氨酸脱亚胺酶。
【技术实现步骤摘要】
一种利用菌株MQO-153制备精氨酸脱亚胺酶的方法
本专利技术涉及一种制备精氨酸脱亚胺酶的方法，具体涉及一种利用菌株MQO-153制备精氨酸脱亚胺酶的方法，属于生物
技术介绍
1914年右贺太郎等从西瓜榨汁中第一次分离得到了瓜氨酸，此后由和田光德认出它是一种氨基酸。瓜氨酸以游离态存在于葫芦科植物的种子中，至今为止，人们已成功从西瓜榨汁中，野西瓜叶中，核桃仁，核桃幼苗及种子中分离得到了瓜氨酸H1。瓜氨酸是一种非蛋白质氨基酸，国外科学家在瓜氨酸方面的研究较多，尤其是在日本、美国和欧洲。在国内，对瓜氨酸的研究却还只是处于认识阶段，生产方法没有相应的报道对其检测方法和生理功能研究的也不多，只有少量的文献报道。岳瑞等用双波长薄层扫描法测定天花粉中瓜氨酸的含量。在研究粗糙孢霉突变株诱导与培养时，发现了瓜氨酸对此突变株有明显的促生长作用。郑春福等研究发现增加细胞外源的L瓜氨酸可明显提高活化巨噬细胞诱生的NO产量，进而降低活化巨噬细胞的感染率，并抑制细胞内弓形虫速殖子的增殖。曾小峰等”“发现抗环瓜氨酸肽抗体在类风湿关节炎的诊断中有重要的作用。在瓜氨酸的生理功能方面，国外科学家已研究得出瓜氨酸具有一些很重要的药理功能，如自由基清除作用，在人体的健康保健方面具有很重要的意义；血管舒张作用，这有望成为治疗内毒症、脓毒症的良药。日本一科学家已研制出一种瓜氨酸新多肽，并将该新多肽研究发展成抗艾滋病药物。同时瓜氨酸被认为是一种非常有效的抗氧化剂，这一功能已应用于化妆品、药物、保健食品等各个领域。近年来国外的众多研究表明，瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，异体排斥效应指示剂，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎，抗氧化等，应用前景十分广阔。在瓜氨酸的制备方法上主要由三种，国外主要采用发酵法和酶法生产，分离纯化多数使用离子交换等常用的分离方法。(1)化学法:是指碱性条件下水解L-精氨酸得L-瓜氨酸，过程控制比较困难，产品中含有旋光对映体D-瓜氨酸，影响产品质量，生产过程中产生大量废水，污染环境，但化学法是国内目前L-瓜氨酸工业化生产的唯一方法。(2)发酵法生产的难点在于单位体积L-瓜氨酸产率低，最高仅为1.7g/L，从发酵液中提取L-瓜氨酸的成本较高。发酵法的优点是成本低，产量高，产物的纯度高，在产品的生产过程中没有有毒物质的产生，给产物后加工提供了方便，降低了成本。目前，对发酵法生产瓜氨酸研究最多的国家是日本，在上世纪30年代就有这方面的研究，到了60年代达到了一定的水平。(3)酶法：是指在精氨酸脱亚胺酶的作用下，L-精氨酸被转化为L-瓜氨酸，生产条件温和，不产生有毒物质，转化体系中杂质较少，提取工艺简单，污染少。该法是以专一性强、转化率高的微生物菌体细胞为催化剂，催化精氨酸脱亚胺基生成L瓜氨酸。利用酶法合成瓜氨酸，大多采用一步酶促反应，因而可避免瓜氨酸全合成途径中复杂的反馈调节作用，使瓜氨酸可以积累到较高的浓度。1973年，IchifoChibata等‘261报道PsudomonasputidaATCC4359，PseudomonasfluorescenIFO3081,PseudomonsovalisiAM1002,LeuconostoccitrovorumATCC8081等可以生产精氨酸脱亚氨基酶，以L-精氨酸或DL精氨酸为底物，可生产瓜氨酸浓度达80班以上。酶法合成瓜氨酸的优点是产物浓度高，纯化步骤少，产品中无D-型旋光对映体，生产工艺简单、成本低。但其缺点是目前酶法很难满足工业生产的要求，原因是依靠动物内脏获得的精氨酸脱亚氨基酶的活性较低，转化率较低，同时精氨酸原料的价格高，影响了瓜氨酸的酶法生产放大。因此，廉价的精氨酸原料价格和精氨酸脱亚胺酶的获得是酶法生产能否成功的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株产精氨酸脱亚胺酶的菌株MQO-153，本专利技术通过对粪链球菌(粪链球菌购自北京微生物菌种保藏中心)多次的化学诱变、紫外诱变，以及经过大量的菌种筛选获得了一株产得的精氨酸脱亚氨基酶活性高的菌株MQO-153，其保藏编号为CGMCCNo.10726；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为2015年4月21；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。菌株MQO-153的生物特性为：菌株MQO-153接种到斜面培养基上进行培养24h，菌形圆或椭圆，可顺链的方向延长，直径0.5-1.0μm，大多数成双或短链状排列，在丰富培养基上菌落大而光滑，直径1-2mm，全缘，无色素。菌株MQO-153的分类命名为粪链球菌(Streptococcusfaecalis)。利用菌株MQO-153制备精氨酸脱亚胺酶的方法，具体为微生物发酵方法，步骤如下：(1)斜面培养：将菌株MQO-153在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养温度为30℃，培养时间为24h，此时，菌落大而光滑，无色素积累；斜面培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20；pH为7.0-7.3；优选为7.2；斜面培养基的灭菌温度115℃，灭菌时间15分钟。(2)扩大培养：从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后的浓度为3×105-5×105个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上置于摇床中进行扩大培养，接种量为10％(v/v)，扩大培养的温度为30℃，培养时间为18h，摇床振幅为85mm，摇床频率为0-18h，摇床转速为100r/min。种子培养基(g/L)：葡萄糖30，牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠15，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.05，硫酸锰0.05，VB1·HCl0.005；用氢氧化钠调节pH为7.0；250mL三角瓶装液量为20mL，1000mL三角瓶装液量为150mL；种子培养基灭菌温度为115℃，灭菌时间为15min。(3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，培养条件为：培养温度30℃，培养时间28小时，摇床振幅85mm，0-10h，摇床转速100r/min，10-20h，摇床转速120r/min，20-28h，摇床转速100r/min；发酵培养基(g/L)：葡萄糖3，酵母膏10，牛肉膏5，蛋白胨10，玉米浆5，酵母膏1，氯化钠5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，L-精氨酸5，硫酸亚铁0.05，硫酸锰0.05，VB1·HCl0.005；用氢氧化钠调节pH为7.2，灭菌温度121℃，灭菌时间20min。(4)30L发酵罐培养：将步骤(3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，控制罐压强为0.05MPa，在30℃条件下培养24小时，搅拌转速600-800rpm，风量1：0.8m3/m3.min(vvm)，控制溶氧量为30-40％，全程用无菌饱和氨水控制pH6.7-7.0，中途补糖控制残糖为1％，放罐残糖为0％，发酵后得精氨酸脱亚胺酶。本专利技术通过微生物酶法生产瓜氨酸，具体为L-精氨酸精经过精氨酸脱亚胺酶的转化制备L-瓜氨酸。本专利技术采用一步酶促反应，避免了瓜氨酸全合成途径中复杂的反馈调节本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用菌株MQO‑153制备精氨酸脱亚胺酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)斜面培养：将菌株MQO‑153在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养温度为30℃，培养时间为24h；(2)扩大培养：从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后的浓度为3×105‑5×105个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上，将种子培养基置于摇床中进行扩大培养，接种量为10％(v/v)，扩大培养的温度为30℃，培养时间为18h，摇床振幅为85mm，摇床频率为0‑18h，摇床转速为100r/min；(3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105‑5×105个/mL，培养条件为：培养温度30℃，培养时间28小时，摇床振幅85mm，0‑10h，摇床转速100r/min，10‑20h，摇床转速120r/min，20‑28h，摇床转速100r/min；(4)30L发酵罐培养：将步骤(3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105‑5×105个/mL，控制罐压强为0.05MPa，在35℃条件下培养24小时，搅拌转速600‑800rpm，风量1：0.8m3/m3·min(vvm)，控制溶氧量为30‑40％，全程用无菌饱和氨水控制pH6.7‑7.0，中途补糖控制残糖为1％，放罐残糖为0％，发酵后得到含有精氨酸脱亚胺酶菌体。...
【技术特征摘要】
1.一种利用菌株MQO-153制备精氨酸脱亚胺酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)斜面培养：将菌株MQO-153在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养温度为30℃，培养时间为24h；斜面培养基为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L；pH为7.0-7.3；(2)扩大培养：从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀释后的浓度为3×105-5×105个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上，将种子培养基置于摇床中进行扩大培养，接种量为10％(v/v)，扩大培养的温度为30℃，培养时间为18h，摇床振幅为85mm，0-18h，摇床转速为100r/min；种子培养基为：葡萄糖30g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠15g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，VB1·HCl0.005g/L；pH为7.0，灭菌温度为115℃，灭菌时间为15min；(3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10％(v/v)，接种时菌体溶液的浓度为3×105-5×105个/mL，培养条件为：培养温度30℃，培养时间28小时，摇床振幅85mm，0-10h，摇床转速100r/min，10-20h，摇床转速120r/mi...
【专利技术属性】
技术研发人员：高法民，高树营，李令娣，
申请(专利权)人：山东民强生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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