一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂制造技术

本发明专利技术属于农业生物防治领域，具体公开了一种用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB27688，其保藏编号为CGMCC No.11457。本发明专利技术还公开了利用该菌制备的微生物菌剂，以及它们在防治番茄灰霉病上的应用。本发明专利技术为防治番茄灰霉病提供了一个高效的微生物，平均防效在80.0％以上，且针对性强；其次，本发明专利技术微生物菌剂对人、畜安全，属于环境友好型；此外，利用本发明专利技术防治番茄灰霉病持效期长，不易产生抗药性；本发明专利技术制备方法简单、成本低、使用简单。

【技术实现步骤摘要】
一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂
本专利技术属于农业生物防治领域，具体涉及一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌，以及含有该解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂，还涉及它们在防治番茄灰霉病上的应用。
技术介绍
番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.)引起的一种重要病害。该病害主要危害果实，造成果实腐烂，也危害叶、茎和花，番茄减产可达20％～50％，损失严重；该病发病后传播速度非常快，严重威胁保护地番茄生产。其病原菌寄主范围较广，除侵染茄科蔬菜外，还可侵染瓜类、甘蓝、菜豆、莴苣、洋葱、苹果等作物。目前，对番茄灰霉病的主要防治方法有：一是化学防治。化学防治虽有见效快、效率高等优点，但是因长期使用会造成环境污染、危害害虫的天敌等缺点，因此逐步被淘汰；其次是生物防治，由于生物防治药效高、持效期长、不易产生抗药性、环境友好等优点日益受到人们的青睐。芽孢杆菌(Bacilliussp)是一种受到广泛关注的生防细菌，以其分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽孢、贮藏期长和使用方便等特点，成为一种理想的生防微生物。因芽孢杆菌能产生内生芽孢，有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，在剂型加工环境中存活、定殖与繁殖。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)是用于防治番茄灰霉病的芽孢杆菌之一，目前，用于防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌主要有CGMCCNo.4777(专利号：ZL201210059785.0)、BA-KA3(专利申请号：201410618581.5)、SZ23(专利申请号：201410683826.2)、LH-1(专利申请号：201410735508.6)和NCPSJ17(专利申请号：201310112580.9)等。由于病原菌的多样性和同步进化特性，因此需要寻找不同的新菌株防治番茄灰霉病。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种防治番茄灰霉病的解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、广谱杀菌活性优点。本专利技术第二目的在于提供一种利用上述解淀粉芽孢杆菌生产的微生物菌剂。本专利技术第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。本专利技术第四目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株在防治番茄灰霉病上的用途。本专利技术第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治番茄灰霉病上的用途。本专利技术第六目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株的鉴定方法。本专利技术第七目的在于提供上述微生物菌剂的鉴定方法。本专利技术通过以下技术方案实现：一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株HMB27688，己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.11457。利用上述解淀粉芽孢杆菌HMB27688生产的微生物菌剂，其活性成分为HMB27688菌体。上述微生物菌剂可以为液体制剂。上述微生物菌剂，其中HMB27688的活菌数大于18.0×108cfu/mL。上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：(1)菌种活化：将低温保存的HMB27688菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mLLB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下培养10～16小时，得种子液；(3)发酵培养：按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基中，在温度为25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养40～50h，得发酵液；(4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为HMB27688菌株的液体制剂。所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。上述制备方法步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基，其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL。上述制备方法步骤(2)中所述的LB液体培养基，其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。上述制备方法步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl0.1～1.0％，MnSO4·H2O0.5～1.0％，其余为水；pH值为7.2。所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、NaCl和MnSO4·H2O混合，再加水，调节pH搅拌均匀即可。上述解淀粉芽孢杆菌HMB27688在防治番茄灰霉病上的应用。上述微生物菌剂在防治番茄灰霉病上的应用。本专利技术微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为107cfu/mL，于番茄灰霉病发病前进行叶面喷雾即可。HMB27688菌株的筛选分离过程HMB27688菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市的棉田土壤中分离得到。2013年4月河北省农林科学院植物保护研究所从湖北省荆州市棉田中五点采集土样，混匀后称取1g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液10mL加入50mL灭菌离心管中，在80℃恒温水浴30分钟，然后取1mL加无菌水9mL，即成10mL10-3倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10-4、10-5、10-6倍稀释液，取各浓度微生物悬液200μL涂于LB培养基平板上，每个浓度重复3次，在30℃恒温培养1d-3d，进行细菌的分离和纯化。并以番茄灰霉病为靶标，通过平板对峙法、离体叶片法、盆栽试验法进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对番茄灰霉病具有明显防治效果的菌株，定名为HMB27688。HMB27688菌株的分类鉴定：(1)形态特征鉴定在LB培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB27688属于芽孢杆菌属(Bacillus)。(2)利用16SrDNA序列鉴定分类以HMB27688的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16SrDNA进行PCR扩增，所述的引物序列为：F27：5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG3’；(SEQIDNo:1)，R1492：5’GGCTACCTTGTTACGACTT3’；(SEQIDNo:2)；16SrDNA的扩增反应体系为50μL:10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB27688，己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11457。

【技术特征摘要】
1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株HMB27688，己于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11457。2.利用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌HMB27688生产...

【专利技术属性】
技术研发人员：李社增，马平，鹿秀云，郭庆港，张晓云，商俊燕，
申请(专利权)人：河北省农林科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13